胡萝卜愈伤组织培养及继代培养.doc

本科学生综合性实验报告学号： 104120265 姓 名： 段昌福 学院： 生命科学学院 专业、班级：10应用生物教育B班 实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验教 师： 杨 世 忠 开 课 学 期： 2013 至 2014 学年 第二 学期 填 报 时 间： 2013 年 6 月 日云南师范大学教务处编印实验序号实验二实验名称胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞悬浮及体细胞胚胎发生培养实验实验时间2013年3月-6月实验室组培实验室（一）、实验目的1.熟练掌握配制与保存培养基母液的基本技能。2.熟练掌握培养基配制的基本技能，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。3.学会设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。4.熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。5.掌握组培室常用的化学试剂。6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。9. 使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。（二）、实验原理、实验流程或装置示意图1、实验原理（1）配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。（2）愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。（3）调节培养基的酸碱性至PH5.8。由于培养基的PH值直接影响到培养一实验设计方案12物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠 （1molL-1）来调节，若过碱就用盐酸 （1molL-1）来调整。当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时5.0时，琼脂不能很好地凝固。（4）植物组织培养的优点： 研究材料来源单一，无性系遗传背景一致； 经济方便效率高； 条件可控误差小； 生长快周期短重复性强； 可周年试验或生产。（5）组织培养实验室布局的总体要求：便于隔离，便于操作，便于灭菌，便于观察。（6）组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。常用的物理方法有：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。常用的化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌。不同物品要选用不同的灭菌方法。实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下：培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下： 压力在9.810410.8104Pa，温度在121，灭菌2030min。玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。超净工作台：紫外灯照射，70%75%的酒精擦洗。外植体灭菌：水冲洗1020min或更长时间 70%75%酒精中浸泡30s 0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右 蒸馏水冲洗45次 备用。2、实验流程（1）实验总体流程：（2）无菌操作流程： （3） 胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：(4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：（三）、实验设备及材料1、实验材料新鲜的胡萝卜贮藏根2、实验设备（1）配制MS母液培养基所需的仪器设备和药品：仪器设备：电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒。药品：NH4NO3、KNO3、CaCl22H2O、 MgSO47H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO44H2O、 ZnSO47H2O、Na2MoO42H2O、 CuSO45H2O、CoCl26H2O、FeSO47H2O、 Na2-EDTA2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸、蒸馏水。（2）配置胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基所需的仪器设备和药品：仪器设备：冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.47.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。药品和试剂：MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH（3）胡萝卜愈伤组织诱导所需设备：仪器设备：100ml三角瓶、500ml搪瓷杯、25ml量筒、10ml和5ml吸管、pH试纸（5.47.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、培养瓶、镊子、解剖刀等。药品和试剂：MS基本培养基母液、愈伤组织诱导培养基、蒸馏水、无菌水、75酒精、蔗糖琼脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、0.1%HgCl2。（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养所需设备：仪器设备：酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、枪状镊子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管、精密pH试纸（5.47.0）、封口膜、橡皮圈、药勺、称量纸等。药品和试剂：愈伤组织继代培养基、75酒精、蒸馏水。(四)、实验方法步骤1、MS母液培养基的配置配置过程以课本33页的配方图为标准。（1）大量元素的配置(CaCl22H2O要在最后单独加入)用量=放大倍数*体积*培养基中的浓度n=20 v=1L（2）微量元素的配置(Fe单独配置)N=200 v=1L（3）有机成分的配置（单一母液）N=200 v=250ml（4）铁盐母液的配置螯合态的铁，混合煮沸 PH=5.8-6.2(用NaOH调)（5）生长调节物得配置2-4-D：0.5mg/ml v=100ml6-BA:0.1mg/ml v=100mlNAA:0.5mg/ml v=100ml注：不能直接加入水中，可先用酒精或NaoH2溶解2-4-D或NAA,用盐酸溶解6-BA。（6）其他常用试剂:75%酒精。2、胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配置配方如下：MS基本培养基 + 2 mg/LNAA +0.1 mgL16BA + 200 mgL1水解酪蛋白 + 3%蔗糖 + 0.7%琼脂粉配制体积：各小组500ml即 大量元素:50 ml; 微量元素：5 ml; 有机物成分：5 ml; 铁盐：5 ml; 2 mg/L NAA：2mg(2ml); 0.1 mg/L6BA:0.1mg (1ml); 200 mg/L水解酪蛋白:200mg; 蔗糖:30g; 琼脂：7g。配制流程：(1)根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。(2)待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。（3）调节培养基的酸碱性至PH6.0。用玻璃棒蘸取溶液，借助PH试纸检测pH，用NaOH和HCl调节PH。（4）配制好的培养基要趁热分装，试管、三角瓶等培养基的容器加注量应占容积的1/31/4，三角瓶每瓶40毫升左右，共分成12瓶。太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧。（5）培养基的灭菌消毒灭菌时，压力表读数为0.11MPa,温度121时保持30分钟左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压之前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的方法：可事先打开放气阀，煮沸等大量热蒸汽排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到一定时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。（6）培养基冷凝后，标记，并置于暗处放置3-7天备用。3、 胡萝卜愈伤组织诱导（1）、实验材料的准备、材料的修整、刷洗、冲洗。、用小刀刮去胡萝卜外表皮，横切取高约1cm的圆柱形胡萝卜块3块。（2）、准备工作、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。、用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。、取下接种器械，在火焰上消毒。（3）、植物材料表面的灭菌与接种、工作人员消毒。、装材料的容器及玻璃棒用酒精进行表面消毒。、将待消毒材料浸入75%酒精中10秒，取出用无菌水冲洗。、移入消毒液HgCl2并计时。（10-15min）、倒出消毒液。、倒入无菌水清洗后备用。（4）、接种与培养、将经消毒的胡萝卜块去除外侧部分后，每一块再切成四小块，给别接种到3个盛培养基的三角瓶内。、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25左右。、接种结束后，清理和关闭超净工作台。4、胡萝卜愈伤组织的继代培养（1）、准备工作接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）。（2）愈伤组织继代培养将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，封口后放置在25 全黑暗条件进行愈伤组织的继代培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。（五）、注意事项1、调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。3.无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。4.废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。5.实验材料大小应适中，不宜太大或太小。6.实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手均需严格消毒灭菌。7.切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。8.接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。9.接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。10.操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。11.灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意以下几点：（1）锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；（2）装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；（3）增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；（4）灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；（5）排气降压时应缓慢进行；（6）只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；(7）高压锅工作时，应有专人看守。12.培养基的保存应注意以下几点：（1）灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。检验是否无菌的方法： 将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。（2）保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。（3）保存时间不可过长。（六）、参考文献1. 李浚明，朱登云.植物组织培养（第3版）.中国农业大学出版社.2005,2.2.王连清主编.植物组织培养.北京：中国农业出版社，2002.3.潘瑞炽主编. 植物组织培养（第三版）.广州：广东高等教育出版社，2003.4.曹孜义，刘国民主编. 实用植物组织培养技术教程.兰州：甘肃科学技术出版 社，2001.5.郭勇，崔堂兵，谢秀帧编著. 植物细胞培养与应用.北京：科学出版社，2004.二实验报告（一）、实验现象与结果1、实验现象胡萝卜愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养1周就可看出诱导结果，1-2周可用于继代培养。胡萝卜在培养过程中的颜色变化如下：橙红色浅黄色乳白色浅绿色(见分析)。2、实验结果（1）胡萝卜愈伤组织诱导培养，共八瓶，最终结果有四瓶诱导成功，且长势良好，其余四瓶均被污染。1、2、3、4号瓶内的胡萝卜愈伤组织长势良好，4、5、6、7、8号瓶内胡萝卜均被污染。其中，,5号瓶部分被污染，号瓶培养基呈浮云状，污染程度底。6、 7号培养基已发黑，8号明显长菌。具体统计如下：表1 胡萝卜愈伤组织诱导结果统计总接种瓶数8总接种块数24污染瓶数4污染块数10未污染瓶数4未污染块数14未污染块中愈伤组织发生块数14愈伤组织发生率100%愈伤组织发生情况 1、2、3、4号瓶内的12块胡萝卜和5号瓶中的两块胡萝卜有愈伤组织产生，1、2、3、4号瓶内的12块胡萝卜生长迅速，5号瓶培养基呈浮云状，但瓶内3块胡萝卜有两块有愈伤组织发生，但生长缓慢。6、7、8号瓶内胡萝卜均被污染， 6、7号培养基已发黑，8号明显长菌，均无愈伤组织产生。记录污染情况及原因分析5、6、7、8号瓶内胡萝卜均被污染。具体情况及分析如下：5号瓶培养基呈浮云状，可能是因为接种时用力将切块压入培养基，破坏了培养基，同时滋生了一系列的好氧细菌的繁殖； 6、7号培养基已发黑，8号明显长菌，其原因可能是外植体自身带菌，或者实验仪器灭菌不彻底，或操作时没有完全掌握无菌操作技术以致引入细菌或真菌，造成污染。无菌操作中，没有保持培养瓶封口膜的无菌条件，最终造成污染； 1、外植体灭菌不彻底，带入细菌；切材料时，下面垫的滤纸有破损或带菌；2、消毒液消毒的时间不够导致灭菌不彻底；或时间过长影响到外植体的生长活性3、镊子、解剖刀等在酒精灯上烧过立即放到盛酒精的烧杯里，将还未完全消除的细菌带入酒精，引起感染，从而影响实验结果。4、操作时，手、三角瓶在盛材料的培养皿上方活动，容易把菌带到材料上。；5、接种前，胡萝卜切块太小，只留下分化程度较高的木质部和髓部，严重影响了脱分化和再分化的速率；（5）、未严格遵守无菌操作技术；（6）、因操作等原因导致灭菌不彻底，器械上带菌；3、胡萝卜愈伤组织继代培养均成功，没有被污染。具体说明如表2：表2 胡萝卜愈伤组织继代结果统计总接种瓶数2存活瓶数2愈伤组织发生情况1号瓶内愈伤组织为型愈伤组织，其结构松脆，生长旺盛，色泽鲜艳，增值很快，称为亢进分裂型。2号瓶内愈伤组织为型愈伤组织，其结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型。本小组2瓶继代培养结果均成功，且长势良好，其他小组则大部分死亡，有的小组甚至全军覆没，分析其原因，本小组成功的原因可能是：（1）胡萝卜愈伤组织继代培养时接种的是纯的胡萝卜愈伤组织；（2）接种取的愈伤组织均较疏松，切块也均较小，是以典型的型愈伤组织为材料接种的；（3）操作较严谨，实验全过程是在严格无菌环境下进行的。4、讨论（1）、MS培养基的特点：无机盐浓度高; 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐;有一定数量的铵盐;营养丰富; 不需要添加更多的有机附加物。（2）、植物组织培养所需的环境条件：与自然条件一样，组织培养中的材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。实验过程中要注意考虑这些条件的影响，并采取适当的措施控制好这些条件。（3）植物组织培养所需的营养成分：植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。 大量元素常常是机体的结构物质； 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节； 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点： a、具有热易变的性质； b、利于吸收和利用；c、使用浓度一般在2%5%； d、提供能源和调节渗透压。维生素类：a、 以各种辅酶的形式存在；b、 参与多种代谢活动；c、 对生长，分化等有很好的促进作用；d、 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素；e、 常用维生素有VB1和VB6。肌醇即环己六醇，其作用是：a、细胞壁的构建材料；b、参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动；c、促进活性物质发挥作用。氨基酸：a、蛋白质的组成成分； b、有机氮源；c、可直接被细胞吸收利用； d、培养基中常用的是甘氨酸。天然复合物：a、促进某些愈伤组织和器官的生长；b、化学成分不明、复杂；c、天然营养混合物。 如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提