植物生理学实验讲义.doc

植物生理学实验（第一版）目录实验一 质壁分离法测定植物组织的渗透势2实验二 植物体内硝态氮含量的测定4实验三 叶绿素a，b含量的测定5实验四 赤霉素对水稻-淀粉酶的诱导形成6实验五 植物呼吸强度的测定7实验六 种子活力的快速测定氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法8实验七 丙二醛含量的测定11实验一 质壁分离法测定植物组织的渗透势实验目的 观察植物组织在不同浓度溶液中细胞质壁分离的产生过程及其用于测定植物组织渗透势的测定实验原理原生质层（细胞膜、原生质、液泡膜）具有选择透过性，近似于半透膜，一个成熟的植物细胞就是一个完整的渗透装置：当外界溶液浓度大于细胞液浓度时(高渗溶液），细胞失水，发生质壁分离；当外界溶液浓度小于细胞液浓度时（低渗溶液），细胞吸水；当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态，当外界溶液浓度等于细胞液浓度时（等渗溶液），植物细胞内的压力势为零时，细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。细胞水势等于细胞液的渗透势等于外界溶液渗透势。将植物组织置于对其无毒害的一系列不同浓度的溶液里处理一定时间，然后镜检发生质壁分离的情况，细胞的等渗浓度将界于刚刚引起初始质壁分离的浓度和不能引起质壁分离的浓度之间。代入公式即可计算渗透势。材料、器材与试剂1 实验材料 洋葱表皮2 实验仪器 显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，刀片，培养皿，记号笔，滴管。3 实验试剂 分别配制0.50、0.45、0.4、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10mol/L的蔗糖溶液，贮9个试剂瓶中。称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1mol/L(母液)。再配制成下列各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml 0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml 0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml 0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml 0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml 0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml方法与步骤1. 取6套干净清洁的小培养皿，用记号笔编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。3.选用有色素的洋葱鳞片的外表皮迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，浸泡20分钟左右。4. 到时后，取出表皮，放在载玻片上，滴一滴相同浓度的蔗糖，盖上盖玻片，在显微镜下观察质壁分离的细胞数如果所有的细胞都产生质壁分离现象，则取低浓度溶液中的制片做同样的观察，并记录质壁分离的相对程度。5. 在实验中确定一个引起半数以上细胞原生质刚刚从细胞壁角隅上分离的最低浓度，和不引起质壁分离的最高浓度。6. 在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直到有把握为止。在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。求得C1按下式计算渗透势 =-iRTC1为细胞渗透势(bar)；R为气体常数(0.083*105L.Pa/molK)；T为绝对温度(273+t)；i解离系数，蔗糖为1；C1 等渗溶液的质量摩尔浓度，单位是mol/kg；实验二 植物体内硝态氮含量的测定实验目的 硝态氮是植物最主要的氮源。植物体内硝态氮含量往往能反映土壤中硝态氮供应情况，因此可作为土壤肥氮肥的指标。测定植物体内的硝态氮含量，不仅能够反映出植物的氮素营养情况，而且对鉴定蔬菜和植物为原料的加工制品的品质也有重要的意义。实验原理在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。材料、器材与试剂1 实验材料 白菜叶片。2 实验仪器 722型分光光度计、电子天平。3 实验试剂 （1）500ppmNO3-标准溶液精确称取烘至恒重的KNO3 0.7221克溶于无离水中，定容至200ml。（2）5%水杨酸一硫酸溶液 称取5克水杨酸溶于100ml，浓硫酸中（密度为1. 84），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。置冰箱保存一周有效。（3）8%氢氧化纳溶液 称取10克氢氧化纳溶于1升无离子水中即可。实验步骤1. 标准曲线的制作（1）吸取500ppmNO3-标准溶液1ml. 2ml. 3ml. 4ml. 6ml. 8ml. 10ml. 12ml分别放入501ml容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成10、20、30、40、60、80、100、120ppm的系列标准溶液。（2）吸收上述系列标准溶液0.11ml，分别放入刻度试管中，以0.11ml无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入0.4ml水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后再加入8%NaOH溶液9. 51ml摇匀冷却至室温，显色液总体积为101ml。（3）以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度。以NO3-N浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2. 样品中硝酸盐的测定（1）样品液的制备，取一定量的植物材料剪碎混匀后，精确称取2-3克分别放入三支刻度试管中，加入10ml无离子水，用玻璃塞封口，置入沸水浴中提取30分钟，到时间后取出，用自来水冷却，将是取液过滤到25ml容量瓶中，并反复冲洗残渣，最的定容至刻度。（2）样口液的测定 吸取样品0.1 ml分别于三支刻度试管中，然后加入5%水杨酸一硫酸溶液0.4 ml，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9. 5 ml 8%NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测期吸光度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出NO3-N浓度，再用下公式计算其含量。实验三 叶绿素a、b含量的测定实验目的 熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。实验原理如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可根据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。根据叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm, 吸收曲线彼此又有重叠。根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系： OD1=Caka1+Cbkb1 (1) OD2=Caka2+ Cbkb2 (2)式中，ka1、 ka2 、kb1、 kb2分别为组分a、b在浓度1g/L时，对应波长为1、2、1、 2时的光密度OD值，即比吸收系数。波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入（1）、（2）式，并解方程可得：Ca=0.00127OD663-0.00269OD645 (3) Cb =0.0229OD645-0.00468OD663 (4).将单位改为mg/L，于是总叶绿素浓度为CT= Ca +Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 (5)器材与试剂1 实验仪器 高级型分光光度计，离心机，天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管等。2 实验试剂 丙酮，碳酸钙，石英砂。3 实验材料 大叶黄杨叶片。实验步骤称取新鲜叶片0.5g 加纯丙酮5ml研磨成匀浆再加80%丙酮5ml，并转入离心管 充分洗涤研钵 离心 定容至20 ml 取上述提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，测定光密度计算各种浓度（Ca 、Cb）。注意事项1 由于植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。2 由于叶绿素a、叶绿素b的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差。实验作业1 为什么提取色素时先用纯丙酮提取，再用80%丙酮提取？2 根据你的实验结果计算出该种植物的叶绿素a、b的比值。3. 根据你的实验结果，计算出该植物每克鲜重叶片中叶绿素的含量（单位用mgg-1FW表示）实验四 赤霉素对水稻-淀粉酶的诱导形成实验目的1通过实验深入了解赤霉素在种子萌发过程中的调控作用。2掌握测定-淀粉酶活的一种简便方法实验原理淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来的赤霉素能诱导糊粉层细胞中-淀粉酶基因的表达，引起-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。外源赤霉素能代替胚的分泌作用，诱导-淀粉酶的形成。-淀粉酶也能将淀粉水解成还原糖，但-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化。将酶液在高温下维持一段时间，钝化-淀粉酶，可准确测定-淀粉酶的活性。材料、仪器设备及试剂1 实验材料：水稻种子 2 实验仪器设备：1. 分光光度计；2. 恒温箱；3. 水浴锅；4. 移液管；5. 烧杯；6. 试管；7. 青霉素小瓶；8. 镊子；9. 刀片。 3 实验试剂：2mol/LNaOH溶液；1%淀粉溶液； 20mg/L赤霉素溶液；0.1mol/L(PH5.6)柠檬酸缓冲液；2，3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂实验步骤1.水稻种子的选择和预处理 选取大小一致、健康的水稻种子，一份放入盛有适量的20mg/LGA溶液中，另一份放入盛有适量清水的培养皿中处理24h,取出后用清水冲洗，置于培养箱中再陪养1d，处理与培养温度均为300C。2.酶的提取 取对照和GA3处理培养的种子2g磨成匀浆到入50ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度混匀放置15-20min（每2min震荡一次）离心（4000r/min,15min） 3.-淀粉酶活性的测定 取试管4只编号（清水试验；清水调零；GA3试验；GA3调零）每管中各加入酶液1ml700C恒温水浴加热12min各加入1ml柠檬酸缓冲液将试验管置于400C恒温水浴15min再迅速加入预热的淀粉溶液2ml400C恒温水浴5min加入NaOH溶液0.5ml终止反应；调零管中加入2mol/LNaOH溶液0.5ml混匀加入预热的淀粉溶液2ml.4.样品的测定 取以上各管中的溶液1ml于15ml刻度试管中加入DNS试剂1ml混匀沸水煮沸5min迅速冷却定容至12ml520nm波长测定OD值。结果计算-淀粉酶活性=（OD520稀释倍数）/样品鲜重/反应时间实验五 植物呼吸强度的测定实验目的熟悉小篮子法测定萌发水稻种子呼吸强度的方法及其计算。 实验原理利用NaOH溶液滴定呼吸过程中释放的CO2，实验结束后，用草酸溶液滴定残留的NaOH，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放的CO2的量。C6H12O6+6O26CO2+6H2O2NaOH+CO2Na2CO3+H2O2NaOH+C2H2O4(草酸) Na2C2O4(草酸钠)+2H2O材料、器材和试剂1.实验仪器锥形瓶，秒表，酸式滴定管，移液管，尼龙网袋2个。2.实验试剂1/44mol/L草酸溶液，0.2M NaOH溶液，1%酚酞。3.实验材料萌发的水稻种子（48h）。实验步骤1. 称取萌发的水稻种子10g，装入尼龙小袋内，把小袋系到锥形瓶塞的小钩上。2. 用移液管吸取20ml NaOH加入锥形瓶中，塞紧瓶塞并立即计时。3. 实验进行30分钟，其间每隔数分钟轻轻摇瓶内的碱液数次。4. 打开锥形瓶塞，滴入酚酞2滴，立即用草酸滴定，滴定至红色突然消失，记下滴定样品消耗草酸的用量。5. 另称取萌发的水稻种子10g，用沸水煮510分钟，作同样测定，以此为对照。实验结果用对照煮过的种子消耗草酸的量v0 ml减去萌发样品消耗草酸的量v1 ml，按每秒消耗1ml草酸相当于1mgCO2来计算种子在呼吸时放出的CO2mg数。呼吸强度（mgCO2g-1FWs-1）=1 mgCO2(v0- v1) W-1t-1式中，W为样品的质量（克），t为呼吸持续的时间（秒）实验作业1. 影响呼吸强度的因素有哪些？2. 为什么用草酸滴定而不用盐酸或硫酸滴定？3. 根据你的实验结果，计算出水稻种子的呼吸强度（单位用mgCO2g-1FWh-1表示）实验六 种子活力的快速测定氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法实验目的熟悉氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法测定种子活力的方法及其计算。【实验原理】德国的 G. Lakon 发明的 TTC 法，简单实用，其原理是：有生活力的种子能够进行呼吸代谢，在呼吸代谢途径中由脱氢酶催化所脱下来的氢可以将无色的 2 , 3 ,5 - 三苯基氯化四唑（ 2,3 , 5 - triphenyl tetrazolium chloride 简称为 TTC ）还原为红色、不溶性的TTF，而且种子的生活力越强，代谢活动越旺盛，被染成红色的程度越深。死亡的种子由于没有呼吸作用，因而不会将 TTC 还原为红色。 种胚生活力衰退或部分丧失生活力，则染色较浅或局部被染色。 因此，可以根据种胚染色的部位以及染色的深浅程度来判定种子的生活力。 【仪器与试剂】1 仪器 培养皿2套；镊子1把；单面刀片1片；垫板(切种子用)1块；烧杯1个；棕色试剂瓶；解剖针1把；搪瓷盘1个；PH试纸。2 试剂 TTC溶液的配制：取3g TTC溶于1L蒸馏水或冷开水中，配制成01的TTC溶液。药液PH应在6575，以PH试纸试之(如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水)。【实验步骤】1将水稻新种子、陈种子或死种子，用温水(30)浸泡26H，使种子充分吸胀。2随机取种子2份，每份200粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子的一半备用。3把切好的种子分别放在培养皿中，加TTC溶液，以浸没种子为度。4放入3035的恒温箱内保温30Min。也可在20左右的室温下放置4060Min。5保温后，倾出药液，用自来水冲洗23次，立即观察种胚着色情况，判断种子有无生活力。【注意事项】1TTC溶液最好现用现配，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。2染色温度一般以2535为宜。3判断有生活力的种子应具备的特征：胚发育良好、完整、整个胚染成鲜红色；子叶允许有小部分坏死，但其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其他部位完好。4判断无生活力的种子应具备的特征：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；子叶不染色或丧失机能的组织超过12；胚染成很淡的紫红色或淡灰红色；子叶与胚中轴的连接处或在胚根上有坏死的部分；胚根受伤以及发育不良的未成熟的种子。5对于不同作物种子生活力的测定，所需试剂浓度、浸泡时间、染色时间不同。现将主要作物种子生活力测定所需要的条件列入表1。表1 TTC法测定主要作物种子生活力要点作物种子 准备TTC浓度（%） 在35下染色时间（h)水稻去壳纵切 0.1 23高粱、玉米及麦类作物纵切 0.1 0.51棉花、荞麦、蓖麻剥去种皮 1.0 23花生、甜菜、大麻、向日葵剥去种皮 0.1 34大豆、菜豆、亚麻、二叶草无须准备 1.0 34二、红墨水染色法【实验原理】有生活力的种子其胚细胞的原生质具有半透性，具有选择吸收外界物质的能力，某些染料如红墨水中的酸性大红G不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失活力的种子其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收的能力，染料进入细胞内使胚部染色，所以可根据种子胚部是否染色来判断种子的生活力。【仪器与试剂】仪器 与TTC法相同。试剂 红墨水溶液的配制：取市售红墨水稀释20倍(1份红墨水加19份自来水)作为染色剂。【方法步骤】1.先将待测种子用水浸泡34H，待充分吸胀后取出一部分种子，在沸水中煮沸35Min，作为死种子。2.取浸好的新种子、陈种子和死种子各50粒，如为小麦和玉米，则用单面刀片沿胚部中线纵切成两半，其中一半用于测定。3.将准备好的种子分别放在培养皿内，加入红墨水溶液，以浸没种子为度。4.染色1020Min后倾出溶液，用自来水反复冲洗种子，直到所染颜色不再洗出为止。5.对比观察冲洗后的新种子、陈种子和死种子胚部着色情况。凡胚部不着色或略带浅红色者，即具有生活力的种子，若胚部染成与胚乳相同的红色，则为死种子，把测定结果记入表16-1(同TTC法)。 【思考题】1. TTC法和红墨水测定种子生活力有何不同实验七 丙二醛含量的测定实验目的熟悉叶片中丙二醛（ MDA ）的测定方法及其计算。 实验原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（ MDA ）是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸（ TBA ）反应生成红棕色的三甲川（3,5,5三甲基恶唑 2,4- 二酮），在 532nm 处有最大光吸收，在 600nm 处有最小光吸收，该复合物的吸光系数为 155，可按公式： A532A600 = 155000