阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌活性的研究.doc

阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌活性的研究李兰，何家康，汤树生，张朝明，郭召绪，肖希龙*（中国农业大学 动物医学院，北京 100193）南宁兽药科技网专稿 编辑2010-8-1 谢绝转载！摘要：为了考察阿莫西林与硫酸粘菌素的联合抗菌活性，进行了阿莫西林与硫酸粘菌素单用及联用对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌以及巴氏杆菌的体外药敏试验。采用微量稀释法测定两药对5种病原菌的最小抑菌浓度，依据所测结果，用棋盘稀释法测定两药联用时的FIC指数，判断其联合抗菌活性。结果表明，在57株受试菌中，呈协同作用的占7.02%，相加作用的占85.96%，无关作用的占7.02%，无拮抗作用。表明阿莫西林与硫酸粘菌素联用主要呈现相加作用，两者联用可以增强药效。关键词: 阿莫西林；硫酸粘菌素；联合抗菌；FIC指数近年来，我国兽医临床畜禽疾病多呈混合感染或继发感染，导致现有单一抗感染药物无法控制多种病原体混合感染的局面，因此，联合用药已成为克服单一抗感染药物抗菌范围有限而不能有效防治混合感染的缺陷的一种较好方案。兽医临床上，阿莫西林是防治金葡菌、链球菌等G+感染的常用药物，而硫酸粘菌素常用于治疗大肠杆菌、沙门氏菌等G-感染性疾病。如能合理开发阿莫西林和硫酸粘菌素复方制剂，将是防治畜禽混合感染性疾病的有效措施。目前，国内外尚未见阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌作用的研究报道，因此本试验旨在通过考察阿莫西林与硫酸粘菌素联合用药的体外抗菌活性，为复方制剂的研制提供科学依据。1. 材料1.1 供试药品 阿莫西林：含量99.5%，批号20080312，珠海联邦制药股份有限公司提供；硫酸粘菌素：含量23694IU/mg，批号N0710003J，丽珠集团福州福兴制药股份有限公司提供。1.2 受试菌株 大肠杆菌17株、金黄色葡萄球菌10株、沙门氏菌株、链球菌16株、巴氏杆菌株（均由中国农业大学药理与毒理教研室提供，系临床分离致病菌)。质控菌为大肠杆菌ATCC25922，购自中国药品生物制品检定所。1.3 培养基 MH肉汤、小牛血清（供链球菌，巴氏杆菌培养用）。2. 方法2.1药物储备液的配制及保存 抗菌药物储备液的配制方法见表1。两药配制后无菌分装至2mL塑料离心管，封口后置于-20冰箱保存，阿莫西林有效期为1个月，硫酸黏菌素有效期3个月。2.2 菌液的制备 菌种经复壮、重新划板分离单个菌落，接种到2mLMH肉汤中，于37培养12h。以平板计数法进行细菌计数，用MH肉汤稀释使菌液最终浓度为1106CFU/mL。2.3 药物原液的稀释 参照CLSI提供的药物敏感性范围及已发表文献报道的阿莫西林、硫酸粘菌素对上述5种细菌的MIC值，确定稀释药物溶液的浓度范围。试验时用MH肉汤稀释至所需工作浓度。表1 抗菌药物储备液的配制抗菌药物溶剂储备液浓度(g/mL)阿莫西林pH6.0，0.1mol/L磷酸缓冲液1280 硫酸粘菌素超纯水25602.4 单药最低抑菌浓度(MIC)测定方法取灭菌的96孔板，A-H八排分四组，每组测1株菌。无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液由低浓度至高浓度分别加到96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔每孔100l，第12孔不加药液作为生长对照。接着将制备的菌悬液每孔100l加入第1至11孔。第12孔加入200l菌液，作为阳性对照。阴性对照及质控菌的MIC均在单独的96孔板上进行。密封后将96孔板置于37恒温培养箱内培养1620h后观察记录结果。试验重复三次。链球菌试验的孵育时间为2024h。2.5 联合药敏试验 以单药最低抑菌浓度（MIC）试验结果为依据，肉汤稀释棋盘法设计两药的4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍和1/16倍MIC进行77联合。将阿莫西林、硫酸粘菌素原液用MH肉汤稀释至所需药物浓度。试验设计如表2所示，选取96孔板A-H排的1-8孔作为试验区域，阿莫西林的7个浓度由低至高以纵列方式分别从第7纵列至第1纵列加入，每孔50l，第8纵列作为硫酸粘菌素的单药对照。硫酸粘菌素的7个浓度由低至高以横列方式分别从G排至A排加入，每孔50l，H排作为阿莫西林的单药对照。阿莫西林、硫酸粘菌素的单药对照孔内加相对应浓度的药液100l。然后最后各孔加入100l上述制备的菌悬液，H排第8孔加200l菌液，作为阳性生长对照。阴性对照在单独的96孔板中进行。将96孔板放于37恒温培养箱，18小时后观察并记录结果。2.6 结果判定2.6.1 MIC结果判定 当阳性对照孔内细菌明显生长，阴性对照孔未见细菌生长，质控菌MIC在质控范围内时，以无细菌生长孔的最低药物浓度为该药的MIC。当出现单一跳孔时，记录抑制细菌生长的较高药物浓度。如出现多处跳孔，结果无效，需重复试验。2.6.2 FIC结果判定1选择最佳组合效应时各自的MIC甲药联用、MIC乙药联用以计算FIC指数。FIC指数计算与判读标准：FIC指数0.5为协同作用；FIC指数在0.51间为相加作用；FIC指数在12间为无关作用；FIC指数2为拮抗作用。3结果3.1 阿莫西林与硫酸粘菌素单用的MIC结果阿莫西林对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌以及巴氏杆菌的MIC范围分别为2.0512.0g/mL，0.1252.0g/mL，0.5512.0g/mL，0.0150.5g/mL，0.0310.50g/mL；硫酸粘菌素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌以及巴氏杆菌的MIC范围分别为0.1254.0g/mL，8.0128.0g/mL，0.1258.0g/mL，128.01024.0g/mL，4.0128.0g/mL。 表2 阿莫西林、硫酸粘菌素肉汤稀释棋盘法试验设计药物阿莫西林硫酸粘菌素单药对照加药浓度4MIC2MICMIC1/2MIC1/4MIC1/8MIC1/16MIC硫酸粘菌素4MIC2MICMIC1/2MIC1/4MIC1/8MIC1/16MIC阿莫西林单药对照阳性对照注：表示加入阿莫西林 表示加入硫酸粘菌素 表示阿莫西林、硫酸粘菌素两药联合等量加入3.2 阿莫西林与硫酸粘菌素联合药敏试验结果表3 阿莫西林与硫酸粘菌素联合药敏试验结果菌种（株数）协同作用（%）相加作用（%）无关作用（%）拮抗作用（%）平均FIC值大肠杆菌（17）5.8888.245.8800.80 金葡球菌（10）3070000.59 沙门氏菌（8）0100000.91 链球菌（16）093.756.2500.87 巴氏杆菌（6）066.6733.3300.98总计（57）7.0285.967.0200.82 阿莫西林与硫酸粘菌素联合药敏试验的结果见表3。57株受试菌株中4株呈协同作用，所占比例7.02%；49株呈相加作用，所占比例85.96%；4株呈无关作用，所占比例7.02%；无拮抗作用。阿莫西林与硫酸粘菌素联用对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，链球菌，巴氏杆菌FIC指数的平均值分别为0.80，0.59，0.91，0.87，0.98。对所有受试菌FIC指数的平均值为0.82。3.3 阿莫西林与硫酸粘菌素联用对5种细菌的FIC指数构成比例图1 阿莫西林与硫酸粘菌素联用对5种细菌的FIC指数分布图阿莫西林与硫酸粘菌素联用对5种细菌的FIC指数构成比例见图1，从图1可以看出，FIC指数主要分布在0.5-1范围内，表明阿莫西林和硫酸粘菌素联用后对5种受试菌的抗菌效果以相加作用为主。4.讨论随着近年来兽医临床混合感染性疾病越来越严重，联合用药已成为有效防治混合感染的缺陷的一种较好方案。兽医临床上，阿莫西林和硫酸粘菌素分别为防治金葡菌、链球菌等G+感染和大肠杆菌、沙门氏菌等G-感染的常用药物。因此，兽医临床上常见联合使用单方阿莫西林和硫酸粘菌素制剂来防治G+和G-菌混合感染。如能合理开发阿莫西林和硫酸粘菌素复方制剂，可扩大抗菌谱、增强抗菌效力，并能减少药物用量和减轻动物应激反应。国内外现已有一些关于阿莫西林或硫酸粘菌素与其它药物联合应用的研究报道，肖华平2等通过体外联合药敏试验表明阿莫西林、阿米卡星联用对沙门氏菌具有协同作用；康宇3等采用棋盘法研究表明氟苯尼考与粘菌素联用对猪大肠杆菌、链球菌分离株具有协同效果。此外，亦有许多报道表明硫酸粘菌素与多种药物联合应用具有协同作用（利福平4, 5、环丙沙星、磺胺嘧啶钠、对氨基苯甲酸6、诺氟沙星7、头孢他定8、恩诺沙星9、硫酸黄连素10）。但至今仍未见关于阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌效果方面的研究。因此，本文对此两种药物的体外联合抗菌活性进行了较系统的研究。本文57株受试菌株的联合药敏感试验结果显示，85.96%（49/57）的受试菌对两药联用呈相加作用，7.02%（4/57）的受试菌呈协同作用，7.02%（4/57）的受试菌呈无关作用，两药联用未见拮抗作用。其中阿莫西林与硫酸粘菌素联用对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，链球菌，巴氏杆菌FIC指数的平均值分别为0.80，0.59，0.91，0.87，0.98；对所有受试菌FIC指数的平均值为0.82。结果表明两药联用主要以相加作用为主，联用可以增强疗效。此外，从FIC指数还可以看出，两药联用后对于不同敏感度的细菌的增效程度也有差异，其增效顺序为：不敏感或耐药株增效程度中度敏感株增效程度高度敏感株增效程度，表明两药联用可以有效抑制或杀灭耐药菌株，减少耐药菌株的产生。综上所述，阿莫西林、硫酸粘杆菌素两药联用可扩大抗菌谱，有效防治畜禽混合感染或继发感染，并可减少给药剂量，减少耐药株的产生。因此，如能通过合理的制剂技术，将两药制成复方制剂，无疑是防治畜禽混合感染的一种有效措施。参考文献1 戴自英. 临床抗菌药物学. 北京: 人民卫生出版社, 19856 Tomasi L, Giovannetti L, etal. Depletion of the residues of colistin and amoxicillin in turkeys following simltaneous subcutaneous administration. Vet Res CommunJ, 1996, 20(2): 175-1822 肖华平, 黄忍. 阿莫西林与阿米卡星对沙门氏菌的体外联合药敏试验. 中国兽药杂志J, 2006, 40(09): 34-363 康宇, 律海峡, 胡功政，等氟苯尼考与黏菌素联用对猪大肠杆菌与链球菌的体外抗菌作用. 河南农业科学J, 2008(09): 116-1184 Giamarellos-Bourbolis EJ, Xirouchaki E, Giamarellou H.Interactions of colistin and rifampin on mltidrg-resistant Acinetobacter baumannii.Diagn Microbiol Infect DisJ, 2001, 40(3): 117-1205 Giamarellos-Bourbolis EJ, Karnesis L, Giamarellou H.Synergy of colistin with rifampin and trimethoprim/slfamethoxazole on mltidrg-resistant Stenotrophomonas maltophilia.Diagn Microbiol Infect DisJ, 2002, 44(3): 259-2636 唐建国. 环丙沙星、多粘菌素、磺胺嘧啶和对氨基苯甲酸间联合的协同作用. 国外医药抗生素分册J, 1994, 15(5): 383-3847 尹孝仁，朴胜春，姜成哲，等. 诺氟沙星和几种抗生素的联合应用效果的研究. 延边农学院学报J, 1995, 17(03)8 Gunderson BW, Ibrahim KH, Hovde LB, etal. Synergistic activity of colistin and ceftazidime against mltiantibiotic-resistant Pseudomonas aerginosa in an in vitro pharmacodynamic model.Antimicrob Agents ChemotherJ, 2003, 47(3): 905-9099 吴俊伟, 杨俊卿. 恩诺沙星与硫酸黏菌素联合抗菌活性的研究. 西南农业大学学报J, 2006, 28 (4): 558-56110 吕小虎, 张晓旭, 陈桂平，等. 硫酸黄连素与硫酸粘菌素的体外联合抑菌研究. 现代农业科学J, 2008, 15(09): 20-21基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目“兽用复方新制剂的研制与应用”(2006BAD31B08)作者简介：李 兰（1983-)，女，硕士生，主要从事兽医药理学与毒理学研究通讯作者：肖希龙，电话E-mail：南宁兽药科技网专稿 编辑2010-8-1 谢绝转载！阿莫西林与硫酸粘菌素联用对5种细菌的FIC指数构成比例见图1，从图1可以看出，FIC指数主要分布在0.5-1范围内，表明阿莫西林和硫酸粘菌素联用后对5种受试菌的抗菌效果以相加作用为主。4.讨论随着近年来兽医临床混合感染性疾病越来越严重，联合用药已成为有效防治混合感染的缺陷的一种较好方案。兽医临床上，阿莫西林和硫酸粘菌素分别为防治金葡菌、链球菌等G+感染和大肠杆菌、沙门氏菌等G-感染的常用药物。因此，兽医临床上常见联合使用单方阿莫西林和硫酸粘菌素制剂来防治G+和G-菌混合感染。如能合理开发阿莫西林和硫酸粘菌素复方制剂，可扩大抗菌谱、增强抗菌效力，并能减少药物用量和减轻动物应激反应。国内外现已有一些关于阿莫西林或硫酸粘菌素与其它药物联合应用的研究报道，肖华平2等通过体外联合药敏试验表明阿莫西林、阿米卡星联用对沙门氏菌具有协同作用；康宇3等采用棋盘法研究表明氟苯尼考与粘菌素联用对猪大肠杆菌、链球菌分离株具有协同效果。此外，亦有许多报道表明硫酸粘菌素与多种药物联合应用具有协同作用（利福平4, 5、环丙沙星、磺胺嘧啶钠、对氨基苯甲酸6、诺氟沙星7、头孢他定8、恩诺沙星9、硫酸黄连素10）。但至今仍未见关于阿莫西林与硫酸粘菌素联合抗菌效果方面的研究。因此，本文对此两种药物的体外联合抗菌活性进行了较系统的研究。本文57株受试菌株的联合药敏感试验结果显示，85.96%（49/57）的受试菌对两药联用呈相加作用，7.02%（4/57）的受试菌呈协同作用，7.02%（4/57）的受试菌呈无关作用，两药联用未见拮抗作用。其中阿莫西林与硫酸粘菌素联用对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，链球菌，巴氏杆菌FIC指数的平均值分别为0.80，0.59，0.91，0.87，0.98；对所有受试菌FIC指数的平均值为0.82。结果表明两药联用主要以相加作用为主，联用可以增强疗效。此外，从FIC指数还可以看出，两药联用后对于不同敏感度的细菌的增效程度也有差异，其增效顺序为：不敏感或耐药株增效程度中度敏感株增效程度高度敏感株增效程度，表明两药联用可以有效抑制或杀灭耐药菌株，减少耐药菌株的产生。综上所述，阿莫西林、硫酸粘杆菌素两药联用可扩大抗菌谱，有效防治畜禽混合感染或继发感染，并可减少给药剂量，减少耐药株的产生。因此，如能通过合理的制剂技术，将两药制成复方制剂，无疑是防治畜禽混合感染的一种有效措施。参考文献1 戴自英. 临床抗菌药物学. 北京: 人民卫生出版社, 19856 Tomasi L, Giovannetti L, etal. Depletion of the residues of colistin and amoxicillin in turkeys following simltaneous subcutaneous administration. Vet Res CommunJ, 1996, 20(2): 175-1822 肖华平, 黄忍. 阿莫西林与阿米卡星对沙门氏菌的体外联合药敏试验. 中国兽药杂志J, 2006, 40(09): 34-363 康宇, 律海峡, 胡功政，等氟苯尼考与黏菌素联用对猪大肠杆菌与链球菌的体外抗菌作用. 河南农业科学J, 2008(09): 116-1184 Giamarellos-Bourbolis EJ, Xirouchaki E, Giamarellou H.Interactions of colistin and rifampin on mltidrg-resistant Acinetobacter baumannii.Diagn Microbiol Infect DisJ, 2001, 40(3): 117-1205 Giamarellos-Bourbolis EJ, Karnesis L, Giamarellou H.Synergy of colistin wit