普通肝素雾化吸入对急性肺损伤大鼠肺泡局部凝血及纤溶的影响.doc

普通肝素雾化吸入对内毒素肺损伤大鼠肺泡局部凝血及炎性反应影响的研究研究背景：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是重症监护病房（intensive care unit，ICU）常见的临床综合征，其病理生理发展过程的严重阶段即为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。ALI/ARDS在脓毒症（sepsis）患者中最为多见，发生率可达401，并且对危重症患者的预后有着非常严重的影响，死亡率高达40602。ALI/ARDS早期病理生理变化的主要特征是肺泡-毛细血管膜通透性增加、通气/血流比值失调、表面活性物质失活和肺顺应性降低。除此之外，近些年的研究发现在肺泡局部还存在以凝血、抗凝与纤维蛋白溶解异常改变为特征的凝血病。其主要表现为凝血亢进、抗凝和纤溶活性受抑制以及纤维蛋白过量沉积，而肺泡的纤维蛋白沉积已成为ALI/ARDS和肺部感染的重要特征3。这种肺内凝血病的范围和程度还会随着损伤严重程度而变化4。肺泡局部产生的促凝与抗凝因子存在不平衡，纤溶活性减弱以及渗漏到肺泡腔的含有纤维蛋白原的血浆蛋白共同导致了肺泡内纤维蛋白的沉积。炎症反应过程中会激活多种免疫细胞，并释放促炎细胞因子，而由凝血激活，纤溶抑制引起的凝血病同样也是炎症反应的特征。凝血病现已被认为是脓毒症的内在变化，因此对凝血病的干预也就成为了脓毒症病人治疗时需要给予重视的途径5。肺泡局部凝血的激活有证据显示脓毒症时凝血的激活主要是通过组织因子（TF）启动的6, 7。正常情况下，仅有少量TF暴露于血液循环，但脓毒症时由于血管壁完整性受到破坏，内毒素、补体以及白细胞介素-6（IL-6）等促炎因子诱导内皮细胞和循环血细胞表达TF8, 9，使得TF大量增加并接触到了血液。TF能结合并活化游离（F）因子，使其成为Fa因子，TF-Fa复合物再激活下游的凝血级联反应，最终活化凝血酶。然而，除促凝外Welty-Wolf等在灵长类动物的脓毒症实验中发现TF-Fa复合物还能促进ALI等器官损伤的发生10。更有研究证实TF-因子途径介导了肺炎时肺泡内凝血酶的活化11。凝血酶的主要功能是水解纤维蛋白原使其转变为纤维蛋白。虽然纤维蛋白是修复和正常创伤愈合过程中所必需的物质，但它在血管外持续、过量的沉积则会产生众多有害效应。纤维蛋白能交联表面活性物质并使其失活，造成肺泡萎陷和肺顺应性降低。它和其降解产物还具有很强的趋化作用，可增强中性粒细胞向肺部聚集，并增加肺血管通透性、影响炎症细胞的迁移和增殖12。由于局部天然抑制因子的产生使得抗凝系统难以对抗增强的促凝活性。蛋白C（PC）系统是人体内主要的内源性抗凝系统，活化蛋白C（APC）可灭活a、a因子，还具有直接抗炎和抗纤维化作用。各种原因导致的APC减少在肺部急性炎症的病理生理发病机制中均可见到 12。纤溶酶原激活剂可活化纤溶系统溶解已形成的血凝块，纤溶酶原激活抑制因子-1（PAI-1）是其主要的内源抑制剂。ALI/ARDS病人纤溶酶原激活剂和PAI-1的失衡造成了抗纤溶活性增强引起纤溶抑制造成肺泡腔内的纤维蛋白无法被溶解，而持续大量堆积。凝血因子和炎症介质间有广泛的相互作用，可互相调节13。肺内的凝血异常也会促进局部的急性炎症反应。纤维蛋白本身就具有促炎特性，可促使炎症细胞聚集和炎症因子释放。另外，a和TF-a因子复合物可通过蛋白酶激活受体（PAR）的介导参与肺部的炎症反应过程。这种肺内的凝血病与sepsis时全身血管内发生的凝血异常类似。因此，通过肝素等抗凝剂调节凝血和纤溶系统的异常来阻止肺内纤维蛋白沉积和具有促炎活性的凝血物质产生，纠正血凝倾向，进而改变肺泡局部的炎症反应进程减轻肺组织损伤也就成为了治疗AL I/ARDS的方向之一。目前已有部分研究结果支持肝素局部给药能缓解ALI/ARDS动物肺部损伤 。在急性肺部炎症和慢性间质性肺病病人的支气管肺泡灌洗液（BAL）中就经常能够见到在促凝血活性增强的同时会出现纤溶活性下降。在各种ALI动物模型中观察到了肺泡中凝血平衡都具有较为一致的变化。肺泡腔局部凝血和纤溶的改变与脓毒症病人全身所发生的变化非常类似。大量研究资料表明凝血病是全身炎症反应情况下，尤其是脓毒症的一种重要现象。在炎症初始阶段会释放出高浓度的肿瘤坏死因子（TNF-）、白细胞介素-6（IL-6）等促炎因子。这些因子通过TF激活凝血，并刺激纤溶酶原激活抑制物的释放来减弱纤溶活性。此外，脓毒症时由于产生减少和降解增加造成天然抗凝物活化蛋白C、抗凝血酶、组织因子途径抑制物降低。研究目的：通过抗凝剂干预sepsis的ALI动物模型的实验研究探讨普通肝素局部大剂量给药能否起到预防和改善肺内凝血、抗凝、纤溶异常以及其对炎症反应的作用。研究方案：(一) 模型制备Wistar大鼠87只，雄性，体重200-250g。在12：12小时昼夜节律的环境中饲养，标准大鼠维持饲料喂养，自由饮水。采用静脉注射大肠杆菌055：B5制备的脂多糖（LPS）（Escherichia coli 055:B5 from Sigma）的方法制备sepsis的ALI模型。用固定器将大鼠固定后经尾静脉把溶于0.5ml生理盐水的LPS经尾静脉缓慢注射。LPS按7mg/kg计算用量。(二) 实验流程1. 分组及处理：所有大鼠随机分为4组，分别是：假损伤组（n=15）：静脉注射0.5ml 0.9盐水2小时后开始给予0.9盐水雾化吸入，每6小时（2、8、14和20小时）1次，共4次；盐水雾化吸入组（盐水组，n=24）：在LPS注射2小时后开始给予0.9盐水雾化吸入，每6小时（2、8、14和20小时）1次，共4次；普通肝素雾化吸入治疗组（肝素治疗组，n=24）：在LPS注射2小时后开始按6U/g给予普通肝素雾化吸入，每6小时（2、8、14和20小时）1次，共4次。普通肝素雾化吸入预防组（肝素预防组，n=24）：LPS注射前30分钟及注射后开始按6U/g给予普通肝素雾化吸入，每6小时（6、12和18小时）1次，共4次。各组内再分为3个亚组，亚组的大鼠数量相等。大鼠按亚组分别在静脉注射后6、12和24小时处死并采集标本。所有大鼠均在LPS或盐水注射后按2ml/kg每6小时腹腔注射乳酸林格氏液（6、12和18小时）1次进行补液。2. 雾化吸入：采用旁流喷射雾化装置给大鼠进行雾化吸入，氧流量至少10 l/min，雾化时间1015分钟或直至没有可见的雾气产生为止。盐水或普通肝素雾化容量均为10ml。用大鼠固定器固定大鼠后进行雾化吸入。3. 标本采集：大鼠处死后采集标本。动脉血采集：从腹主动脉采集抗凝动脉血2ml。肺湿/干重比值：大鼠处死后切取左肺，吸干表面血污后称湿重，然后在烘箱中60，烘干48h，如果24h和48h干肺重量无变化，则用48h的干肺重量计算肺的湿/干重比。肺泡灌洗液：按0.3ml/100g腹腔注射10水合氯醛麻醉大鼠，打开胸腔，将右肺用2ml冰生理盐水灌洗3次，共6ml，冰盐水灌入后停留30 s，收集灌洗液。1h之内将灌洗液保存在4冰箱中以备下一步处理。灌洗液在4 1500g（4700 r/min）离心15min，提取上清液后-80保存以备检测。病理学标本：切取部分右肺组织用10中性甲醛固定24h，石蜡包埋，切片，常规苏木精-伊红（HE）染色观察。按Smith的标准进行评分。肺组织匀浆制备：取部分右肺组织（0.2-1g）最少可到2-5mg在冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml小烧杯中。用移液管量取预冷的0.86生理盐水，生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍（1mg肺组织，1L盐水），用移液器取总量2/3的生理盐水与烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎组织块（天热时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep 150型超声发生器以振幅14m超声处理30s使细胞破碎，也可用国产超声发生仪，用400安培，5 s/次，间隙10s反复3-5次。机器匀浆：用组织捣碎机10000-15000 r/min上下研磨制成10组织匀浆，也可用内切氏组织匀浆机制备（匀浆时间10 s/次，间隙30s，连续3-5次，在冰水中进行）。最后4，10000g（12000 r/min）离心5min。留取上清液供检测髓过氧化物酶活性（MPO）之用。(三) 检测指标1. 凝血与抗凝指标ELISA法检测肺泡灌洗液中的凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complexes，TATc）、APC2. 纤溶指标ELISA法检测肺泡灌洗液中的纤溶酶原激活剂（plasminogen activator activity，PAA）活性、PAI-1活性3. 炎症指标ELISA法检测肺泡灌洗液中的肿瘤坏死因子-（TNF-）、白细胞介素-6（IL-6）、MPO活性4. 肺损伤指标肺湿/干重比、动脉血氧分压（PaO2）、肺组织病理学检查参考文献：1. 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