MTT实验方法步骤.doc

一悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。每孔取100l的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20l，培养4h，再加入10SDS100l，测定570nm处的A值。计算公式如下：杀伤活性（）=(1实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)100本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412 4162SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm520nm波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过28。（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。要用MTT法，可以选用无酚红的无色培养基，离心吸取部分上清，不要吸走底部细胞和formazan,剩下部分放烤箱烘干。就不会影响你的测定了。二悬浮肿瘤细胞MTT法检测细胞生长抑制率时采用的细胞裂解液配方及如何配制1细胞种于96孔板中，6小时左右后，加入受试药物,继续培养72小时后加入20 ul 5mg/ml的MTT，37温育4小时，加入100 ul三联液（10SDS5异丙醇12mMHCl），温育1220小时，用平板读数计在570nm处测定每孔的光密度值（OD值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算2检测悬浮细胞生长抑制率用CCK-8试剂比较好，操作比较简单，误差比较小。三悬浮细胞，何时加药物？细胞接种孔板时？1一般文献报道的方法，是贴壁细胞在细胞贴壁后加药物（一般为上板后24h），而悬浮细胞是上板同时加。 但是，我个人的经验，药物加的时机并不是固定的，具体要根据你实验本身的要检测的指标。如果你要做有关细胞增殖的药物，加药的时机影响不大，主要是药物的作用时间起决定性因素。但是，如果你要检测的是其他一些指标，比如，如果你想做药物对细胞黏附功能的影响，可能就要在细胞贴壁 以前就要加药了。2贴壁细胞一般在试验前1-2日接入孔板， 太晚，细胞在传代后有一个小时左右的停滞期，此时代谢变慢，增殖缓慢，及对数曲线的底部，此时的MTT数值太低了， 太早了，实验时候，细胞生长过头，此时有死亡和凋亡的细胞，实验时本底又过高， 让试验时落在对数早中期最好四悬浮细胞如何做mtt?1一种方法加MTT， 孵育，离心，去上清，每孔加入DMSO。振荡10分钟后选择波长，测OD值；这种方法较麻烦，尤其是没有平板离心机的情况下。另一种方法是酸化异丙醇法：细胞悬液离心，弃上清，加MTT，孵育，加入酸化异丙醇，离心，取上清测OD值。后者推荐使用。2悬浮细胞可以用EP 管离心，但是，一般悬浮细胞是养在培养板里的，如果你再把悬浮细胞转到EP管里，再离心，会很累的。最好用平板离心机离心，如果没有，只能转到EP管里再离了。但是，转来转去的，会丢失细胞不说，还有可能影响到细胞的活力。DMSO和酸化异丙醇原理应当差不多，活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化物（MTT）由黄色还原为兰色的甲赞,后者溶于有机溶剂（二甲基亚枫、酸化异丙醇）,甲赞产量与细胞活性成正比。可用酶标仪测定其OD值。3异丙醇中加入HCl配成0.04mol/L。不同的时间加入不同的药物，你可以使用可拆式细胞培养板呀。一般实验你要做几个复孔的，所以，一个板子，有的时候显得还不够用呢。你还可以用二十四孔板，六孔板呀。多买几个板子，同时培养，但是在不同的时间处理。比如二十四小时的时候拿出一个来做MTT。再过二十四小时，第二个板子就已经培养了四十八小时，你再拿出来做MTT。五SDS方法：用0.01N HCL溶解SDS（要求纯度要高，sigma的最好），10；加入MTT继续培养4小时，96孔培养板不用离心，直接加入100ul孔（培养量为100ul 孔），置CO2培养箱过夜，直接测定。溶液颜色很稳定，72小时内变化不大。六S180细胞是悬浮的，能否用MTT测定OD值？1可以用MTT测定OD值的。具体方法如下：细胞种于96孔板中，6小时左右后，加入受试药物,继续培养72小时后加入20 ul 5mg/ml的MTT，37温育4小时，加入100 ul三联液（10SDS5异丙醇12mMHCl），温育1220小时，用平板读数计在570nm处测定每孔的光密度值（OD值）.细胞增殖生长抑制率和增效率分别按公式计算。（吸取上清后，我用DMSO与细胞混匀后作用5-10分钟。570nm的波长。一般不用三联液的。）2tedzh wrote:可以。具体方法如下：1.细胞种于96孔板中，加入受试药物。2.继续培养至所需要的时间。3.10ul10mg/ml的MTT，1200rpm,5min.4.37、5%CO2、饱和湿度温育4小时。5.4000rpm,10min6.倒板去上清。7.加入DMSO振荡反应10MIN8.测A570七我在做药物对细胞的影响，细胞是K562，现在要做MTT,在加MTT之前，是不是一定要把药物洗掉？因为是悬浮细胞，怎么洗？洗会不会对细胞数有影响？1贴壁细胞也没有说还要洗掉药物的，但是在加入DMSO之前，实际上还是把培养液给吸掉了，而药物就溶解在培养液里头。如果你的悬浮细胞MTT法最后是通过 离心后去上清,加DMSO溶解结晶的方法来检测的话，实际上你还是洗掉了药物的干扰了。如果刻意地“离心弃上清液加MTT”，或者“离心弃上清液培养液重悬离心弃上清液加MTT”，往往得不偿失，会在瓶壁上/或者操作过程中损失掉一些细胞的，影响实验结果。2也有人说当体积小于一百微升时可以直接加MTT,如果不影响结果的话。还要看你的药物和MTT有没有反应。八mtt原理和方法：1MTT法的原理是：包括肿瘤细胞在内的有核细胞线粒体呼吸链上的琥珀酸脱氢酶能把3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)还原成蓝色的甲2MTT法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l1：接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100010000个细胞接种到96孔板，每孔体积100或200ul.2:培养细胞：同一般培养条件，培养24-48小时3：加入受试药物，一般5-7个浓度，每个浓度3个复孔，同时设空白对照，不加药物的阴性对照和阳性对照。.4：呈色：培养24-48小时后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加100ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。5：比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值注意事项：（1）选择适当得细胞接种浓度。（2）注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。（3）若药物与MTT能够反应，第四步时可以先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。九上面的回复都是从书上抄的，我第一次做时，就按书上的做，就见不到formasan形成，第二次我把细胞加大到200000/ml, MTT反应时间加至5小时才出结果，所以要看自己的细胞决定具体试验条件。另外关于选择490nm或570nm波长，如果用二甲亚砜中止反应，用492nm；如用酸化异丙醇，用570nm。附上我做MTT是查的资料，希望有用用MTT比色法测定细胞增殖活性，取对数生长期细胞,以不同浓度加入96孔板,细胞浓度从高到低每孔依次为28104,14104,7104,3.5104,1.75104,0.825104,0.412104,0.206 104,0.103104,每孔100l,置于37,5%CO2、饱和湿度条件下孵育一定时间（分别做出培养1，2，3，4天的板子）,然后在反应板中加入MTT(5 mg/ ml) ,每孔10l或20l,同上条件继续培养4h,离心,去上清。各孔加入二甲基亚砜(DMSO)或10%SDS100l,溶解MTT还原产物,微型震荡器震荡5min后,室温放置0.5h分别用全自动酶标仪测定492nm波长吸光度(A)值。结果如下图：（摘自MTT 比色法的条件探讨方蓉,李芳秋等 临床检验杂志2003 年第21卷第1 期Chinese Journal of Clinical Laboratory Science ,2003 ,Vol121 ,No11）。 MTT体外药敏实验：细胞：取指数生长期细胞进行实验，细胞接种密度可查阅相关文献.试剂： 药物工作液（终浓度）：连续10倍稀释的5个浓度,如30，3，0.3，0.03，0.003 MTT溶液：临用前用生理盐水溶解，60水浴助溶，浓度为 5mg/ml。三联溶解液：SDS 10g异丁醇 5ml10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液细胞接种与加药：将一定密度的肿瘤细胞90l/孔接种于96孔微量培养板内,然后加入药液10l/孔,每种药5个浓度(每个浓度相差10倍),一个浓度设4个复孔。每块板设一个空白调零孔,内加细胞培养液100l，不含细胞与药物。每种细胞设6个正常对照孔,加样100l/孔(即有肿瘤细胞的培养液)，不含药物。接种完毕后在37， 5%CO2条件下孵育培养48小时。1 加MTT：加MTT溶液(5mg/ml)20l/孔,混匀后37，5%CO2 条件下孵育4小时。2 加三联液：加溶解三联液100l/孔，混匀后37放置过夜以溶解甲臢。3 吸光度（A）测定：测定波长为570nm，校正波长为630nm。96孔板附图于附件ppt文件.D药物，为正常对照，为空白调零孔 以下的protocol供参考：1. Make a solution of 5 mg/mL MTT1 dissolved in PBS and filter sterilized.2. 5 hours before the end of the incubation add 20 uL of MTT solution from step one to each well containing cells.3. Incubate the plate in a CO2 incubator at 37 oC for 5 hours.4. Remove media with needle and syringe.5. Add 200 uL of DMSO to each well and pipette up and down to dissolve crystals.6. Put plate into the 37 C incubator for 5 minutes.7. Transfer to plate reader and measure absorbance at 550nm司徒先生授课：1、制备单细胞悬液：0.25%胰蛋白酶消化，用培养液配成细胞悬液接种细胞：每孔103-104细胞（100200ul）接种于96孔板中2、预培养：37，5%CO2及饱和湿度下培养24h施加影响因素：如药物，培养3-5天3、加MTT （0.5%） ：每孔1020ul，培养424h4、溶解结晶物：吸弃孔内培养液，勿破坏孔内结晶物，每孔加入150ulDMSO，震荡5-10分钟5、比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，先调零（按调零键），再按统计键，然后各孔分别按测量键，最后按统计键，自动打印比色结果6、绘制曲线：以细胞数或作用因素（如药物浓度）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制曲线。十我在MTT中遇到几个问题，百思不得其解，问了不少老师，也是不得要领，盼望各位行家能够指导一二。（1）.关于测量波长的问题，我在文献上见有用490nm，还有用570nm，甚至还有选用其他波长的，不知波长的选择是根据什么做出来的？（2）.我在文献（Freshney RI. Culture of animal cells：a manual of basic technique. Third Edition. A John Wiley & Sons, Inc, Publication. New York.1994.）中见到，在用DMSO溶解结晶紫以后，再加入Sorenses缓冲液（0.1M氨基乙酸，0.1MNaCl，用1MNaOH调节pH至10.5），不知Sorenses缓冲液在此处是什么作用？（3）.我是用DMSO溶解结晶紫的，我遇到一个老师，他说我这是一个老土的办法，建议我改用SDS，不知DMSO与SDS的区别在什么地方？有什么优缺点？请各位行家多加指导。我在这里先谢过了。你好，关于波长的选择，我在实验前也查了不少资料，测定波长（measure absorbance）范围在550 600 nm，校正波长（measure absorbance）大于650 nm，根据你处仪器情况，具体选择。（我查到多数外文文献中提到的测定波长为570nm，校正波长为630nm。）这样选择的原因见附图，图中虚线部分为MTT紫外吸收光谱，实线为甲臢（formazan）吸收光谱，可见550600nm为甲臢的吸收高峰，在该范围内测定可提高检测的敏感性，且避免MTT干扰。而选择校正波长是为了去除细胞碎片，指纹（？）或其他非特异因素造成的干扰（reduce background contributed by excess cell debris, fingerprints and other nonspecific absorbance.），当然你可以不选择校正波长，在国内的不少文章中，并没有选择校正波长，但国外文章一般都选