同位素应用.doc

同位素的应用同位素示踪在生命科学中的应用在生命科学中，示踪方法（见同位素示踪）主要用于测定组织的成分、研究物质在生物体内的转移以及物质代谢转变三个方面。 组织成分的测定核素分析的测量灵敏度远比常用的化学分析高。最灵敏的化学分析能够测量 1g左右的物质，而能够被验定的放射性物质，有时可以达到 10-8乃至10-11g量级。常用的方法有以下几种。同位素稀释法适用于分析微量或测定难于同其他物质定量分离的物质。在生物化学中，使用同位素稀释法可以不作定量分离而对混合物的某一成分进行定量测定，从而解决了分离由化学性质相似的物质组成的混合物的困难。竞争放射分析法是一种特殊的同位素稀释法，可以测定体液中极微量的具有生物活性的物质。这种方法灵敏度高、特异性强、标本及试剂用量少、操作比较简便、快速、应用范围广、可以用于常规诊断，以及疾病普查和医学科学研究。全身计数全身计数器是测定人体内总放射性的快速而灵敏的仪器。它能测出比容许剂量低得多的放射性和人体内存在的钾-40等天然放射性,即使每千克体重仅含10-8居里级的放射性,也能被它探测出来。体内钾-40占全身钾总量的比例(0.0118)是恒定的，因此，从全身计数器所测出体内钾-40的含量,就可以算出全身钾总量。对肌肉萎缩患者，使用全身计数器，就能从测出体内的钾量确定疾病的严重程度。物质在生物体内的转移把待研究的物质加以标记，就有可能追踪这些物质在机体内的转移及其转移速度，研究吸收、摄取、浓集、分布、分泌、排泄、通透性、血流速度、肿瘤定位、分子内反应位置和药物作用原理等问题。例如，将磷-32标记的结核杆菌制成气溶胶,给小鼠吸入，于不同时间测定肺、食道、肝、肾等部位的放射性，就可以了解这种通过呼吸道感染的细菌在体内分布和贮留的规律。物质的代谢转变同位素示踪在生物学中最重要的应用是研究物质的代谢转变，也就是研究生命活动中不断进行的生物化学过程。前身和产物如果将以核素标记的物质 A引入动物体，经过一段时间，从排出物或组织中分离出另一化合物B，含有相当数量的上述标记核素，即可得出结论：A在动物体内可以转变为B。生物合成示踪实验还证明了：体内许多大分子都是由很小的分子合成的。如胆固醇分子是由乙酸分子合成的。为了区分乙酸的两个碳原子， 人们可以用碳-13标记羧基酸，碳-14 标记甲基碳。在将此双标记的乙酸(14CH313COOH)同大鼠的肝切片保温一段时间后,从肝脏提取出胆固醇。利用有机化学的降解方法，可以区分胆固醇分子中的每一个碳原子。转变的速度如果给大鼠注射一种氮-15 标记的氨基酸,氮-15很快就标记了动物体内的各种蛋白质。通过观察发现肝脏蛋白质中氮-15 的含量在七天内减少了一半，即在七天中，一半的肝蛋白被更新了。组织内的各种成分，都在不断更新，单位时间内某一代谢物在一定组织中被合成或被分解的速度，称为此代谢物在该组织内的更新率，它一般都用示踪实验测定。 反应机制的探讨示踪实验不仅确立了代谢转变中前身同产物的关系，也常用于探讨代谢转变是如何完成的。运用核磁共振技术研究蛋白质溶液三维结构和动态特性中,蛋白质的同位素标记表达是研究的关键.至今已发展的同位素标记技术和蛋白质表达系统已获得了广泛的应用,对蛋白质的核磁共振研究起到了巨大的推动作用.但是随着蛋白质研究的深入发展,原有的一些常规标记表达技术已不能完全适应核磁共振研究的需要.近年来,陆续出现的一系列同位素标记新技术和蛋白质表达新系统可以满足不同物种来源的蛋白质及更高分子量的蛋白质的核磁共振研究的需要.稳定同位素标记方法在蛋白质组学定量分析中的应用蛋白质表达水平定量分析是蛋白质组学研究的一项关键内容,它依赖于精确的、高通量的、具重复性的技术。目前,应用稳定同位素标记技术定量蛋白质表达水平是最准确的方法之一,且联合色谱质谱技术更具优势。 蛋白质组通常定义为一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学研究的一项关键内容,是在对比环境下对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析,通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异,进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病,从而确定多种致病因子在对机体作用时最。重要的靶分子,为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据。近年来,基于质谱技术,稳定同位素标记技术定量分析蛋白质表达水平获得了很大进展。它是在两套对比标本中用同一核素的不同稳定性同位素标记蛋白或多肽。通常是用富含某种重质同位素(比如:2 H、l3 C、l5 N、l8 O) 的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物,被分析肽段则与正常的同种试剂(即其中所有元素的含量皆为天然丰度) 结合。内标肽段与被分析肽段(组成为一个“分析对”) 除了在质量上相差确定的几个单位外,其他的物理、化学性质几乎完全相同,在标记后的诸多分离纯化过程中,其行为很相似,由于质量数的差异,在质谱图上表现为一对峰,峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数决定。目前,各种不同的稳定同位素应用范围极广,而且在蛋白质组实验的不同阶段,它可以和化学方法或生物方法一起使用。稳定同位素标记技术主要有提取前标记方法(代谢标记方法) 、提取后标记方法及反转标记方法 。代谢标记法代谢标记方法是指利用培养细胞的代谢作用,将标记了核素的蛋白质掺入细胞内的方法。通常将一定量细胞种类相同、蛋白质表达水平不同的两个细胞样品,分别置于正常培养介质和富含某种重同位素的相同培养介质中进行标记。后加标记后加标记法是指先将细胞或组织破碎,提取出相关待分析成份后,再用同位素进行标记。该方法通常用于标记来源不同、细胞状态相同的肽段,待充分反应后,将两者混合,消化酶解成若干个肽段,然后用高效液相色谱( HPLC) 分离,之后用质谱进行鉴定,通过识别并比较质谱图中前后相邻分布峰的强度,确定对比样品对某蛋白质表达水平的差异。其最典型且已商业化的技术是同位素亲和标记技术( Isotope Coded AffinityTages , ICA T) 。ICA T9 化学试剂由生物素部分、同位素标记中间体部分以及半胱氨酸活性烷基化反应连接部分三部分组成。所使用的试剂是含8 个氢原子的(d0) 轻试剂或含8 个氘原子的(d8) 重试剂。一般实验步骤为:将一个蛋白质样本用轻试剂标记,另一个用重试剂标记,然后将两个样本混合,经胰蛋白酶或Lys2C 水解蛋白得到肽片断,混合肽片断,用抗生物素蛋白亲和层析法分离,这些肽段即可进一步通过反向毛细管液相色谱分离后或直接进行质谱分析。质谱分析时得到的质量数相差8 Da 的同位素分子质量峰,若一对峰的质量数相差8 Da ,则为同一种蛋白