核酸类药物.ppt

生物药物分离技术 第二组 2012年10月11日 目录 概述 反义核酸 是指能与特定mRNA精确互补 特异阻断其翻译的RNA或DNA分子 反义核酸技术 利用核酸特异地封闭某些基因表达 使之低表达或不表达的技术它包括反义RNA技术 反义DNA技术和核酶 ribozymes 技术三大技术 概述 反义核酸来源 一是利用固相亚磷酰胺法人工合成的短小反义寡聚核苷酸 AON 二是更具实用用价值的人工表达载体 包括单个基因和多个基因的联合反义表达载体 三是天然存在的反义核酸分子 1 概述 1什么是反义RNA 2什么是反义DNA 1 概述 反义核酸的作用机制 反义核酸作用原理基于碱基配对规则 可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式参与对相关基因表达的调控 其作用方式可能有 反义RNA与mRNA结合形成互补双链阻断核糖核蛋白体同mRNA的结合 从而抑制了mRNA翻译成蛋白质的过程 反义DNA能与靶细胞形成一种三链核酸 triplehelixnucleicacid 它通过作用于控制基因转录的转录子 增强子和启动子区 对基因的转录进行调控 反义核酸与mRNA的结合可阻挡mRNA向细胞质的运输 反义核酸与mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别而降解 从而大大缩短mRNA的半衰期 5抑制转录后mRNA的加工修饰上述四种作用途径都可表现为对基因表达的抑制或调节 且这种调节是非常特异性的 1 概述 概述 反义RNA的作用机制 类 这类反义RNA直接作用于其靶mRNA的SD序列和或编码区 引起翻译的直接抑制 A类 或与靶mRNA结合后引起该双链RNA分子对RNA酶 的敏感性增加 使其降解 B类 类 这类反义RNA与mRNA的SD序列的上游非编码区结合 从而抑制靶mRNA的翻译功能 其作用机制尚不完全清楚 可能是反义RNA与靶mRNA的上游序列结合后会引起核糖体结合位点区域的二级结构发生改变 因而阻止了核糖体的结合 类 这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录 1 概述 概述 核酶 是具有催化功能的RNA分子 是生物催化剂 可降解特异的mRNA序列 核酶又称核酸类酶 酶RNA 核酶 1 概述 剪切型核酸 锤头核酶 发夹核酶 HDV核酶 RNaseP 1 概述 反义核酸的作用特点 反义核酸作为基因治疗药物之一 与传统药物相比具有诸多优点 1 高度特异性 反义核酸药物通过特异的碱基互补配对作用于靶RNA或DNA 犹如 生物导弹 2 高生物活性 丰富的信息量 反义核酸是一种携带特定遗传信息的信息体 碱基排列顺序可千变万化 不可穷尽 3 高效性 直接阻止疾病基因的转录和翻译 4 最优化的药物设计 反义核酸技术从本质上是应用基因的天然顺序信息 实际上是最合理的药物设计 5 低毒 安全 反义核酸尚未发现其有显著毒性 尽管其在生物体内的存留时间有长有短 但最终都将被降解消除 这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色体上的危险性 6 免疫原性低 很少引起免疫反应 概述 1 空间结构2 尽量不与人基因组不同源3 稳定性 1 概述 RNA干涉技术 RNAi 定义 RNA干扰 RNAinterference RNAi 是指在进化过程中高度保守的 由双链RNA double strandedRNA dsRNA 诱发的 同源mRNA高效特异性降解的现象 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达 所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 概述 作用机制 概述 起始阶段 dsRNA进入细胞的方式可以是外源导入或者转基因 病毒感染等 引入的dsRNA被核酸酶RNase 家族中特异识别dsRNA的Dicer酶 以一种ATP依赖的方式逐步切割成长约21 23nt的由正反义链组成的双链小分子干扰RNA siRNA 且每条单链的3 端都带有2个突出的非配对碱基 多数是UU siRNA又被称为引导RNA guideRNA 是识别靶RNA的标志 siRNA的生成启动了RNAi反应 2 效应阶段 siRNA结合一个核酶复合物 形成所谓的RNA诱导的沉默复合物 RNA inducesilencingcomplex RISC 这个核酶复合物由内切核酸酶 外切核酸酶 解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白四种成分组成 激活该复合物需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程 活化以后的RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上 并在距离siRNA3 端12个碱基的位置切割mRNA 另外 通过遗传分析方法发现 线虫中的RDE 1 MUT 7和DNA RNA解旋酶及其他PAZ Piwi蛋白也参与到该阶段的反 概述 siRNA的设计 最有效的siRNAs是时1个碱基大小3 端由两个碱基突出的双链RNA 平行试验来确定最有效的一个 1 概述 双链RNA可先在体外构建好 然后转染细胞 在体外构建双链RNA时 分别在体外转录出正义和反义RNA 再将两者退火 形成双链RNA 体外合成的双链RNA可以用脂质体转入细胞中 但有些细胞脂质体转移效果差 转移到细胞内的双链RNA半衰期短 而先在体外构建能表达双链RNA的载体 再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA 不但能增加有效转染细胞的种类 而且在长期稳定表达载体的细胞株中 双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用 1 概述 应用 注射和转染dsRNA到细胞或生物体是运送的siRNAs主要方式 1 概述 1高通量的研究基因功能2基因敲除3基因治疗4基因表达调控 1 概述 基因治疗作为基因治疗的工具 RNAi既高效特异 又简便易行 RNAi在某个基因表达异常增高引起的疾病中会非常有用 如病毒感染 肿瘤等 CDK 2