霉菌试验技术分析与探讨.doc

霉菌试验技术分析与探讨陈丹明（空军装备研究院雷达与电子对抗研究所，北京 100085）摘要分析了霉菌试验技术对试验结果的影响，并从试验菌种、霉菌孢子、灭菌方法以及试验结果评定等方面对提高霉菌试验结果的可靠性进行了深入探讨。关键词：霉菌；试验技术；可靠性霉菌试验是一项操作程序复杂，技术难度大，专业性强的环境试验项目。整个试验过程中涉及许多技术环节，它们对霉菌试验结果的科学性和准确性评价直接造成影响。因此，熟练掌握和运用霉菌试验技术，对提高试验结果的可靠性和有效性，保证试验的重复性和再现性具有十分重要的意义。1 试验菌种霉菌是一种简单的多细胞微生物。它变异性强，易产生衰退而使原有的典型性状变得不典型。在试验室试验菌种常表现在杂菌污染，菌落和细胞形态的改变，菌苔变薄、生长速度缓慢，产孢子能力越来越弱等现象。试验菌种的纯度和活力大小直接的影响了试验结果的真实性和可靠性。为了保证试验菌种的纯度，使其保持旺盛的生命力，在实践中，应着重考虑以下两点。1.1 菌种纯度纯菌种应向国家级菌种保藏机构如中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）购买，然后自己保藏1。在保藏过程中由于各种原因很容易造成菌种的污染，对于一个受到杂菌污染的菌种是无法保持纯菌种的典型性状，为了保证菌种的纯度，试验人员在操作过程中必须严格按照无菌操作的要求进行操作。若菌种受到杂菌污染，可通过纯种分离的方法如平板划线法、表面涂布法、菌丝尖端切割法等方法分离得到纯菌种。2.2防止菌种衰退微生物都存在着自发突变，这种突变是在繁殖过程中发生或表现出来的。菌种的传代次数越多，产生突变的几率也就越高，因而发生衰退的机会也就越多2。为了防止菌种衰退，一是必须严格控制传代次数，即尽量避免不必要的或过多的接种，减少菌种衰退的几率。比如在得到纯菌种后，可同时接种多支试管斜面，培养至孢子产生后，移至410的冰箱中保藏。需要使用时取1管用来接种，使用23次后废弃，再需接种则另取1管。二是交替使用不同的培养基。如察氏培养基与马铃薯葡萄糖培养基间的交替使用，为菌种创造一个适合的生长条件，在一定程度上可防止菌种衰退。三是利用霉菌孢子进行接种。霉菌菌丝细胞常含有多个核，用菌丝接种往往会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用孢子来接种这种现象就不会出现。四是选用合适的菌种保藏方法。将纯菌种进行有效保藏能防止衰退，保持原菌株的典型性状。菌种保藏方法有许多种，根据霉菌实验室现有条件通常选择斜面低温保藏和液体石蜡保藏两种保藏方法。斜面低温保藏法是将霉菌菌种接种于新鲜培养基斜面，经过培养后，在410低温条件下保存培养基试管斜面的方法。其优点是操作简单，使用方便，不需要特殊设备，能随时检查所保藏法的菌株是否死亡、变异与污染等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。保藏时间较短，通常为24个月，需要定期移植。液体石蜡保藏法是用无菌石蜡油覆盖培养基试管斜面上霉菌菌苔的菌种保存方法。它实用且效果好，保藏2年以上不死。其优点是制作简单，不需要特殊设备，不需要经常接种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大。2.霉菌孢子霉菌试验实质上就是将霉菌孢子接种到受试样品上，并在适宜的条件下孢子萌发形成菌丝体，菌丝体进行生长和繁殖从而对受试样品造成影响。悬浮孢子的溶液、孢子数量以及孢子活力大小直接影响了霉菌试验的结果。2.1悬浮孢子的溶液国内外霉菌试验标准很多，试验方法中有的用无菌蒸馏水悬浮孢子，有的用无机盐悬浮孢子，制成孢子悬浮液。大家知道，霉菌生长所需的营养物质有碳源物质、氮源物质和无机盐，只要提供这些物质，霉菌就可以正常生长与繁殖。实验证明，缺乏无机盐直接影响了孢子的萌发，影响了菌丝体的正常生长3。接种无机盐溶液悬浮的孢子液，只要受试样品上能为霉菌生长提供碳源、氮源物质，霉菌就能正常生长和繁殖。实践证明，样品的长霉效果接种无机盐溶液悬浮的霉菌孢子要比接种无菌蒸馏水悬浮的霉菌孢子的好，所得的试验结果更可靠，更符合实际。因此用无机盐溶液制备孢子悬浮液更具实际意义。2.2孢子浓度在各类霉菌试验标准中对孢子悬浮液浓度的要求并不完全一致，GJB150.10-86、HB5830.13-86规定单个菌种孢子悬浮液中的孢子最终浓度为1.01062105个/ml，而GB2423.16-99要求用100ml无菌蒸馏水稀释8种菌种孢子，GJB4.10-83规定每100ml无菌蒸馏水移入每个菌种的孢子56环，但球毛壳霉可移15环，木霉12环，它们并未规定孢子的具体浓度。由于霉菌种类不同，不同孢子的生理状况也不一样，即使在适宜的生长条件下，各菌种的孢子萌发率、萌发时间以及萌发速度依然存在差别，菌丝体的生长速度快慢不一4，因此对同一样品接种多种霉菌孢子，势必使不同菌株为了生长争夺有限的营养物质形成竞争关系，但不是拮抗关系。这一点通过对GJB150.10-86采用的五株菌的孢子悬浮液进行等浓度等体积混合后接种到马铃薯和察氏培养基平板上，黑曲霉的生长优于其它菌株得到了证实。一般来说，每种菌的易感材料不同，即使对相同的易感材料，由于不同霉菌的生长，造成的影响也不一样。因此，霉菌试验方法中规定混合孢子悬浮液中各菌种的孢子浓度一致体积相等，这有利于减少不同菌株在受试样品表面因接种孢子数量上的差异而出现生长菌株、长霉速度和程度的差异，消除易感菌株生长较弱或未见生长的现象，使试验结果更具真实，更有说服力。这种规定对霉菌试验来说不仅重要而且十分必要。通常微生物的接种浓度在106108个/ml范围之内56，试验表明，霉菌试验中采用1.0106个/ml的孢子最终浓度能达到接种效果，但增加孢子浓度长霉程度是否变得严酷还有待于进一步研究证实。2.3孢子活力检验孢子活力检验是验证接种孢子在合适生长条件下是否具有旺盛的生命力，是判断霉菌试验接种孢子有效性和试验结果可靠性的依据。接种到受试样品上的霉菌孢子是否具有旺盛的生命力，能否正常萌发将直接影响到试验结果。若接种孢子的活力很弱，即便是试验箱内温湿度条件适宜霉菌也不能旺盛生长，试验结果也不准确。孢子活力的检验既可以检查接种孢子的生命力状况，同时与对照样品上霉菌生长状况形成对比，为评判试验的成功与否提供了强有力的证据，为试验的中断处理提供了依据，有利于正确评定试验结果。若孢子活力检验平板和对照样品上霉菌均旺盛生长,说明孢子萌发正常，菌种生命力强,试验箱内温湿度条件合适,试验结果可靠；若孢子活力检验平板霉菌旺盛生长，而对照样品上霉菌长势弱，分析原因可能是试验箱内温湿度条件不够或受到其它微生物的侵袭或感染抑制了接种霉菌的生长,当发生这种现象时应立即中止试验；若孢子活力检验平板和对照样品上霉菌长势均较弱，说明菌种很可能存在衰退，试验无效。因此孢子活力检验在霉菌试验过程中不可缺少。检验孢子活力通常是取单一孢子悬浮液接种在固体培养基平板上，放置在恒温条件下培养710d后观察霉菌生长状况。此法仅能了解孢子能否萌发，菌丝体是否生长，无法知道单位体积内活性孢子的数量（或孢子萌发率）和孢子萌发后单个菌丝体的生命力状况，因而难以保证试验结果的重复性和再现性。霉菌试验的生物学过程是接种孢子在受试产品上萌发，菌丝体生长和繁殖的过程。活性孢子的数量及菌丝体的生命力状况与试验结果有着直接的关系。因此，笔者认为，检验孢子活力的大小应采用平板计数法，即将孢子悬浮液作梯度稀释后倒平板，它既可以计算出单位体积内活性孢子的数量，又可检验单个菌丝体生命力的旺盛程度，因此有助于判断接种菌的状态，分析试验结果。3.灭菌在霉菌试验过程中有许多步骤是要求无菌操作的，因此灭菌是霉菌试验的一个重要环节。灭菌的彻底与否将直接影响试验结果的准确程度。能否确切反映霉菌试验的真实情况，提高试验结果的可靠性，灭菌将起到关键作用。霉菌试验的灭菌主要包括试验所用的器皿、器具以及培养基、对照样品、废弃菌种的灭菌，实验室、超净工作台、霉菌试验箱（室）的灭菌，试验结束后受 试样品的灭菌。根据灭菌对象的不同，应采取不同的灭菌方法。试验所用的器皿、器具以及培养基、对照样品、废弃菌种的灭菌常采用高压蒸汽灭菌。此方法应用普遍、效果最好，具有灭菌彻底、经济、快速、无臭无毒、安全性好等特点。进行灭菌时必须将灭菌器内冷空气完全排除，并控制好灭菌温度和时间（通常在1.05 kg/cm2，121.3条件下灭菌2030min），达到完全灭菌的目的。霉菌实验室的灭菌与一般微生物实验室不同。一般微生物实验室通常采用紫外线灯进行灭菌。试验证明，紫外线灯对真菌不具有杀伤作用，故对霉菌实验室、超净工作台、霉菌试验箱（室）的灭菌常采用每立方米空间用甲醛溶液10ml和高锰酸钾5g产生的蒸气与紫外线联合消毒灭菌，可以达到良好的灭菌效果。也可采用臭氧进行灭菌，臭氧灭菌时臭氧浓度常为10mg/m3,此灭菌方法作用快速、无死角，灭菌效果明显7。对实验室内的墙壁、地面、桌椅和不耐高温的物品可用5%的石炭酸进行擦洗1。试验结束后受试样品的灭菌必需及时，首先需去除样品上生长的霉菌及霉菌孢子，然后再进行灭菌处理。灭菌时可以与实验室一同进行，也可以将其集中在一个小空间内用环氧乙烷熏蒸灭菌。霉菌试验方法中虽然未对灭菌作具体要求，但必须引起足够的重视。无论在试验前还是在试验后均采取灭菌措施，并在试验过程当中严格按照无菌操作的要求进行操作，才能有效消除其它微生物对试验的干扰，这对提高试验结果的准确性、保证试验结果的重复性和再现性无疑起着决定性作用。5.试验结果等级评定现行标准对试验结果等级评定主要是用霉菌生长面积占受试样品表面积的百分比来衡量受试样品的长霉程度，确定受试样品的长霉等级，而对样品表面长霉程度的描述没有作出具体规定，只是通过肉眼观察进行判断，误差较大。判别试验样品合格与否,基本上是通过试验后评定的长霉等级以及产品技术文件规定的合格判据（目前绝大多数合格判据中只规定长霉等级并未对样品作其它任何要求）来确定。这样的评定方法十分粗糙，是不科学的，存在许多不合理之处。实践经验表明，在描述长霉结果时，不仅要描述霉菌生长部位、生长方式（分散、菌落、厚重等）和颜色、生长面积、繁茂程度，还应确定霉菌是生长在试件材料上还是生长在试件表面的污染物上，长霉后对试件造成诸如变色、开裂、起泡、腐蚀等可视的结构变化以及对试件造成的性能变化，若有特定要求还应进行更多的特别描述。在评定长霉等级时，不应只看长霉面积，而更应注重根据试件上不同材料及其长霉结果、破坏程度（有时样品上长霉面积虽小，但着生的少数几个菌落大而厚，破坏性很大）以及对试件造成的影响分别进行评定。在判定试件合格与否时，不应只根据长霉等级来决定，还应考虑组成产品的材料、产品使用环境及使用要求、产品的技术条件、制造工艺以及试验后样品出现的其它现象等多方面因素进行综合判断。只有这样评定的结果才更具科学性和合理性，也更符合实际需要。6.小结霉菌试验是考核产品或材料抗霉能力的重要手段，试验结果的科学性、合理性至关重要。但影响霉菌试验结果稳定性和一致性的因素很多，要提高霉菌试验结果的可靠性，试验技术是关键，因此技术人员不仅需要具备扎实的专业知识和专业技能，还需要丰富的实践经验和对产品的全面了解，并能从微生物学和环境工程、材料、结构和工艺等多学科多领域去认识霉菌试验，科学合理地评判试验结果，更好地为产品选材、结构设计、工艺选择、产品运输存贮及使用提供可靠的信息，提高产品或材料的抗霉菌能力。参考文献1吴绍熙主编.现代医学真菌检验手册M.北京:北京医科大学-中国协和医科大学联合出版社,1998.2周德庆著.微生物学教程M.北京:高等教育出版社,1999.3刑来君,李明春著.普通真菌学M.北京:高等教育出版社,2001.4HuShangqinResearch of the Time of the Growth Cycle on the Military Standard Fungus.Journal of Microbiology Mar.2004 Vol.24 No.2:2729.5WOLK D M，JOHNSON C H，RICE E W，MARSHALL M M，GRAHN K F，PLUMMER C B，STERLING C RA Spore Counting Method and Cell Culture Model for Chlorine Disinfection Studies of Encephalitozoon syn. Septata intestinalis. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(4):1266-1273. 6 GrnyRafa L，Reponen T，Willeke K，Schmechel D，Robine E，Boissier M，Grinshpun S A. Fungal Fragments as Indoor Air Biocontaminants. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(7)