分析化学（季桂娟）光度分析.ppt

第五章吸光光度法 5 1吸光光度法的基本原理 5 2光度分析的方法和仪器 5 3吸光光度法的灵敏度与准确度 5 4显色反应与分析条件的选择 5 5吸光光度法的应用 化学分析 常量组分 1 Er0 1 0 2 依据化学反应 使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较 仪器分析 微量组分 1 Er1 5 据物理或物理化学性质 需要特殊的仪器 例 含Fe约0 05 的样品 称0 2g 则m Fe 0 1mg 重量法m Fe2O3 0 14mg 称不准 容量法V K2Cr2O7 0 02mL 测不准 光度法结果0 048 0 052 满足要求 准确度高 灵敏度高 5 1吸光光度法的基本原理 特点灵敏度高 测定下限可达10 5 10 6mol L 或10 4 10 5 准确度能够满足微量组分的测定要求 相对误差2 5 1 2 操作简便快速应用广泛 吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法 一 光学光谱区 10nm 200nm 200nm 380nm 380nm 780nm 780nm 2 5 m 2 5 m 50 m 50 m 300 m 二 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱 不同颜色的可见光波长及其互补光 二 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱 300 400 500 600 700 nm 350 525545 Cr2O72 MnO4 Cr2O72 MnO4 的吸收光谱 350 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 吸光度与光程的关系A K1b 朗伯1760年 c c c 三 光吸收基本定律 Lambert Beer定律 吸光度与浓度的关系A K2c 比尔1852年 2C C 1 光吸收基本定律 Lambert Beer定律 A lg I0 It kbc 朗伯定律 1760 A lg I0 It k1b 比尔定律 1852 A lg I0 It k2c 朗伯 比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据 应用于各种光度法的吸收测量 T 透光率 透射比 Transmittance A lg I0 It lg 1 T lgT kbc 2 吸光度A 透射比T与浓度c的关系 3 K 吸光系数 Absorptivity 当c的单位用g L 1表示时 用a表示 A abca的单位 L g 1 cm 1 当c的单位用mol L 1表示时 用 表示 摩尔吸光系数 MolarAbsorptivity A bc 的单位 L mol 1 cm 1 反映用吸光光度法测定某物质的灵敏度 4 朗伯 比尔定律的适用条件 1 单色光应选用 max处或肩峰处测定2 吸光质点形式不变离解 络合 缔合会破坏线性关系应控制条件 酸度 浓度 介质等 3 稀溶液浓度增大 分子之间作用增强 01234mg ml A 0 80 60 40 20 溶液浓度的测定 A bc 工作曲线法 校准曲线 5 朗伯 比尔定律的分析应用 6 吸光度的加和性与吸光度的测量 A A1 A2 An 用参比溶液调T 100 A 0 再测样品溶液的吸光度 即消除了吸收池对光的吸收 反射 溶剂 试剂对光的吸收等 5 2光度分析的方法和仪器 方便灵敏准确度差 1 目视比色法 是用眼睛观察 比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法 比较的是透过光的强度 c1 c2 c3 c4 一 光度分析的几种方法 2 吸光光度法 是借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度 绘制标准曲线 然后根据被测试样的吸光度 从标准曲线上求得被测物质的浓度含量 比较的是有色溶液对某一波长光的吸收情况 二 分光光度计 通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光 波长可调 故选择性好 准确度高 三 分光光度计的类型 5 3吸光光度法的灵敏度与准确度 一 灵敏度的表示方法 摩尔吸光系数 A bc L mol 1 cm 1 越大 灵敏度越高 104 5 104为中等灵敏度 105为高灵敏度 104为低灵敏度 例1邻二氮菲光度法测铁已知 Fe 1 0mg L b 2cm A 0 38计算 解 c Fe 1 0mg L 1 0 10 3 55 85 1 8 10 5mol L 1 朗伯 比耳定律的偏离 标准曲线法测定未知溶液的浓度时 发现 标准曲线常发生弯曲 尤其当溶液浓度较高时 这种现象称为对朗伯 比耳定律的偏离 引起偏离的因素 两大类 1 物理性因素 2 化学性因素 二 准确度 1 物理性因素 难以获得真正的纯单色光 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带 复合光可导致对朗伯 比耳定律的正或负偏离 2 化学性因素 朗伯 比耳定律的假定 所有的吸光质点之间不发生相互作用 假定只有在稀溶液c10 2mol L时 吸光质点间可能发生缔合等相互作用 直接影响了对光的吸收 故朗伯 比耳定律只适用于稀溶液 溶液中存在离解 聚合 互变异构 配合物的形成等化学平衡时 使吸光质点的浓度发生变化 影响吸光度 2 仪器测量误差 光度计的读数误差一般为0 2 2 T 由于T与浓度c不是线性关系 故不同浓度时的 T引起的误差不同 浓度测量的相对误差与T 或A 的关系 实际工作中 应控制T在15 65 或A在0 2 0 8之间 调c b 显色反应的选择 灵敏度高 一般 104 选择性好 显色剂在测定波长处无明显吸收 对照性好 max 60nm 反应生成的有色化合物组成恒定 稳定 显色条件易于控制 重现性好 1 显色反应 5 4显色反应与分析条件的选择 一 显色反应与显色剂 O 生色团 N N N O O 无机显色剂 SCN Fe SCN 2 H2O2 TiO H2O2 2 有机显色剂 2 显色剂 一 显色反应与显色剂 C S N 共轭双键 e 有机显色剂 OH COOH SO 3 H OO型 N N N O H OH ON型 PAR NH N S N S型 双硫腙 NN型 丁二酮肟 邻二氮菲 磺基水杨酸 NH 二 显色条件的确定 c R c R c R 1 显色剂用量 c M pH一定 Mo SCN 32 浅红Mo SCN 5橙红Mo SCN 6 浅红 Fe SCN n3 n 2 显色反应酸度 c M c R 一定 pH1 pH pH2 pH 邻二氮菲 亚铁反应完全度与pH的关系 Fe2 3R H H A 柠檬酸 c R R 10 4mol L 1 3 1021 3 3 FeR3 pH3 8为适宜的酸度范围 3 显色温度及显色时间 另外 还有介质条件 有机溶剂 表面活性剂等 T1 T2 t min A 三 干扰的消除 Co2 Fe3 Co2 FeF63 Co SCN 2 蓝 NaF SCN Co2 Fe2 Sn4 2 Sn2 Co SCN 2 SCN a 掩蔽法 1 化学法 测Co2 含Fe3 Co2 Zn2 Ni2 Fe2 CoR ZnRNiR FeR CoR Zn2 Ni2 Fe2 钴试剂R H 测Co2 如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰 则需采取分离法 测Fe3 Fe3 Cu2 FeSS 紫红 Cu2 pH2 5 SS b 控制pH 生成络合物性质不同 2 物理法 选择适当的测定波长 515 655 415 500 钍 偶氮砷III 钴 亚硝基红盐 A A 络合物 络合物 试剂 试剂 1 当试液和显色剂均无吸收时 可用蒸馏水作参比溶液 2 显色剂无吸收 而被测试液中存在其它离子有吸收 可用不加显色剂的被测溶液作参比溶液 如测汽水中的Fe3 显色剂有吸收 可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液 3 选择适当的参比溶液 4 显色剂和试液均有吸收 可将一份试液加入掩蔽剂 将被测组分掩蔽起来 使之不再与显色剂作用 而显色剂及其它试剂均按试液测试方法加入 以此作为参比溶液 这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰 5 改变加入试剂的顺序 使被测组分不发生显色反应 可以此溶液作为参比溶液消除干扰 3 选择适当的参比溶液 5 5吸光光度法的应用 一 单一组分测定 1 金属离子 Fe phen Ni 丁二酮肟 Co 钴试剂 2 磷的测定 DNA中含P 9 2 RNA中含P 9 5 可得核酸量 H3PO4 12 NH4 2MoO4 21HNO3 NH4 3PO4 12MoO3 12NH4NO3 12H2O 磷钼黄 小 磷钼 V 蓝 大 3 蛋白质测定 溴甲酚绿 考马司亮蓝等 4 氨基酸测定 茚三酮 紫色化合物 5 水质检测 NH4 NO2 Mn2 Fe2 SO42 Hg2 6 紫外吸收 UV NO2 NO3 SO42 SO32 CO32 SCN 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 蛋白质等 二 多组分的测定 a 在 1处测组分x 在 2处测组分y 二 多组分的测定 b 在 1处测组分x 在 2处测总吸收 扣除x在 2处的吸收 可求y 二 多组分的测定 xl1 eyl1 exl2 eyl2由x y标液在 1 2处分别测得 c x y组分不能直接测定在 1处测得A1 A1 exl1bcx eyl1bcy在 2处测得A2 A2 exl2bcx eyl2bcy 三 高含量组分的测定 示差法 普通分光光度法一般只适于测定微量组分 当待测组分含量较高 A 0 8 时 采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液 设待测溶液浓度为cx 标准溶液浓度为cs cs cx Ax bcxAs bcs x s b cx cs b c测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差 Cx Cs C 四 络合物组成的测定 1 摩尔比法 固定cM 改变cR 2 等摩尔连续变化法 M nR MRn 五 一元弱酸离解常数的测定 HLH L Ka H L HL 高酸度下 几乎全部以HL存在 AHL HL c HL 低酸度下 几乎全部以L存在 AL L c HL 代入整理 或 配制一系列c相同 pH不同的溶液 测A 六 双波长分光光度法消除干扰 不要求 在 2 A 2 Ax2 Ay2在 1 A 1 Ax1 Ay1 A A 2 A 1 Ax2 Ay2 Ax1 Ay1 Ax2 Ax1 Ax Ay2 Ay1 Ax x2 x1 bcx消除了y的干扰 七 导数分光光度法 不要求 A 图 混合物导数光谱 0 1 2 3 4 1 了解 分子对光的吸收与溶液颜色的