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医学论文-肺表面活性蛋白B在新生儿呼吸窘迫综合征中的作用【关键词】 肺表面活性蛋白B 新生儿 呼吸窘迫综合征新生儿呼吸窘迫综合征（respiratory distress syndrome of newborn，NRDS）是引起新生儿呼吸衰竭的主要疾病，也是新生儿特别是早产儿死亡的主要原因。其发病主要机制是由于缺乏肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS），导致肺泡表面张力增加，肺泡塌陷。临床医学、流行病学及生物化学都充分证明NRDS是一种多因素、多基因疾病13。目前认为NRDS与PS中肺表面活性物质蛋白（surfactant protein，SP）合成减少有很大的关系，表面活性蛋白B（SPB）是其中最重要的一种，直接发挥降低肺泡表面张力的作用4。近年来，一些SP的遗传性变异，尤其是SPB基因变异，已被证实是NRDS病因中的危险因子58。国外研究发现新生儿SPB减少或缺陷与某些基因突变相关9。 1 肺表面活性物质 PS是指分布于肺泡内具有降低气液界面表面张力的物质，主要由肺泡型上皮细胞合成，具有高度表面活性，存在于被覆肺泡表面的液体中。其主要生理功能是降低肺泡表面张力，维持肺泡结构之间的相对稳定，调节肺顺应性，防止肺泡萎陷和肺水肿。PS为磷脂蛋白复合物，其中磷脂约占90%，主要存在形式为二棕榈酰卵磷脂（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）和磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG），对降低肺泡表面张力有重要作用。PS中与磷脂分子相互作用的特异性蛋白质称为 SP，约占8%10%。迄今为止已发现4种SP，根据发现的顺序命名为SPA、SPB、SPC、SPD 4种亚型。其中，SPA、SPD为大分子亲水性SP，SPB、SPC为小分子疏水性SP，它们是PS降低肺泡表面张力的必需物质。SP促进磷脂向液体表层分布并扩散，疏水性SPB、SPC功能最强，能独立发挥生理效应，且与SPC相比，SPB作用更强。 2 SPB的分子生物学特性及生理功能 2.1 SPB 分子生物学特性 SPB基因（SFTPB）位于人类第2号染色体短臂，约9.5 kb，由11个外显子和10个内含子组成，第11外显子是不可译的。SFTPB编码2kb mRNA转录物，该转录物在去除23个氨基酸组成的第一信号肽后被翻译成含381个氨基酸的SPB前体蛋白（precursor protein，proSPB），分子量约42kDSPB具有一个典型的疏水性起始序列，使之能顺利通过内质网孔进入加工处理过程。第129131和311313位氨基酸经糖基化作用，N末端糖基化位点被g.1580CT清除，使131位苏氨酸被异亮氨酸取代，再经过由组织蛋白酶H及其它蛋白参与的一系列蛋白水解过程，去除C、N末端的氨基酸，最终形成只有79个氨基酸的成熟 SPB，由第67外显子编码10，11。 SPB的表达具有组织细胞特异性，主要在肺泡型细胞合成和分泌，是以同源二聚体形式存在的疏水性蛋白，由二硫化物连接2条含有79个氨基酸残基的多肽链组成。每条多肽链含有 3个二硫化物桥：Cys8Cys77、Cys11Cys71、Cys25Cys46，每个多肽链的Cys48形成链间二硫键，可维持SPB稳定性。每个SPB分子拥有45个两亲性的螺旋结构区，成双反向平行排列，SPB分子带正电荷。成熟SPB合成后贮存于板层体，其疏水面富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，可与磷脂膜相互作用，共同进入分泌途径。 2.2 SPB 生理功能 SPB的主要生理作用为促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，从而降低肺泡表面张力、防止呼气末肺泡塌陷、增加肺顺应性、促进肺间质液体回流。仅含有SPB和脂质的表面活性物质可以改善PS缺失肺的压力容积曲线，并能有效治疗NRDS动物模型的PS缺失。 2.2.1 促进PS中磷脂吸附 在呼吸过程中，PS磷脂必须快速附着于气液界面并扩展形成单分子膜，才能发挥降低肺泡表面张力的作用。而SPB最重要的功能之一就是促进PS磷脂在气液界面的吸附和扩展。SPB的同源二聚体特性及螺旋结构使其能够与磷脂层结合：SPB分子中亲水性的正电荷基团与磷脂分子首端的极性基团相互作用，而疏水性基团与磷脂分子疏水性的酰基端链相互作用，从而使磷脂在气液平面迅速扩展，加速处于液下相中的磷脂混合物在液气界面形成单分子膜，提高肺表面活性磷脂降低表面张力的作用。SPB的碱性残基在与负离子磷脂的相互作用中也发挥着重要作用，使SPB还能够促进不饱和磷脂，如PG，从磷脂单分子膜中挤出（Squeezeout），从而使单分子膜中的DPPC进一步纯化而更为浓缩，增强磷脂膜的表面活性。若在体外实验中加入抗SPB的单克隆抗体，可显著抑制PS的快速吸附，使表面张力增加。体内实验也显示，给小鼠注射SPB单克隆抗体，或给新生兔气管内滴注SPB单抗，均可引起严重肺损伤和呼吸衰竭，而给予非特异性抗血清则不引起肺损害。因此，SPB对于PS系统发挥其正常的表面活性功能不可缺少。 2.2.2 参与PS在肺泡内的组装和转化 肺泡腔内PS主要有四种结构形式，即板层体（Lamellar body，LB）、管髓体（Tubular myelin，TM）、单分子层及大小不等的单层或多层囊泡，这一排列顺序可能就是PS在肺泡内的转化过程：PS由肺泡型上皮细胞合成后，以LB形式贮存于细胞内。LB以出胞方式分泌入肺泡，在肺泡表面液体层中转换成高度有序呈网格状的TM，后者进而在肺泡的液气界面上形成具有表面活性的磷脂单分子层。继之膜纯化、崩溃为囊泡样结构。因此，TM是表面单分子层的前体。TM形成障碍必将影响PS发挥其正常的表面活性功能。SPB不仅在表面单分子膜的形成中有重要作用，而且在LB转化为TM的过程中也是不可缺少的。体外实验显示，将SPA、SPB、Ca2+ 与磷脂（DPPC 和甘油磷脂）混合孵育时，可产生典型TM样网状结构，若除去SPA或SPB，则不能形成TM样结构，若只加SPA，而无SPB，则只能形成膜外有8 m微粒附着的双层脂膜，表明SPB是TM形成的必需成分。SPB基因缺失鼠的肺内无TM，进一步说明SPB在此方面的重要性。 2.2.3 SPB 促进型肺泡上皮细胞对磷脂脂质体的摄取 其作用机制不详。但对SPC摄取却起抑制作用，提示SPB和SPC在维持气液界面表面活性方面可能起协同作用。SPB还可作用于肺泡巨噬细胞的氧化亚氮合成酶，使其水平下降，能减少脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞产生氧化亚氮。 3 SPB缺失 3.1 SPB基因表达的调节 SP基因属发育控制基因家族，在人类妊娠前3月胎肺中，SPB基本不表达，在妊娠1518周时，气管、支气管上皮细胞即可见SPB mRNA和表达蛋白，此后呈进行性增加；在妊娠1324周内，Northern印记分析表明SPB增加达成年肺的50%。在妊娠后3月内，SPB mRNA及其表达蛋白水平与PS磷脂水平升高平行，合成分泌增加，羊水中可检出这些蛋白。 人类SPB基因启动子为111bp73bp，结构复杂，其中结合有甲状腺转录因子1（TTF1）和肝细胞核因子32（HNF32）。SPB启动子活性依赖于各种因子对启动子上游和下游区的相互作用。TTF1作为特异性转录因子，能进入核内结合SPB基因上游顺式作用元件而实现对SPB基因表达调控。TTF1通过基序CTNNAGTCAAG连接到DNA结合位点。TTF1结合位点的突变可阻碍TTF1重组体与DNA结合，从而显著抑制SPB启动子活性，以致SPB蛋白合成减少。HNF32也有促进启动子的作用。核因子B（NFB）结合位点突变可引起SPB启动子活性降低40%。 SPB基因表达也受一些体液因素的调节。SPB基因中（G/C）GGT（A/T）CA（A/C）NNTGT（C/T）CT片段是可与糖皮质激素受体结合的共同序列，称为糖皮质激素反应元件（GRE）。SPB基因在5端侧序列的700 bp内含有4个GRE。糖皮质激素对SPB有单相上调作用，在人胎肺移植培养中能刺激SPB mRNA表达增强，在H820核H441细胞系中也有相似结果。SP基因中CTGACGTCAG片段是与cAMP调控作用有关的共同序列，成为cAMP反应元件（CRE）。SPB基因的第1内含子中有CRE，cAMP对SPB表达主要是抑制作用。视黄酸（retinoic acid，RA）能促进SPB mRNA的生成及量的增加12。目前，大多数研究均支持RA能够上调SPB基因表达，具体通过RARAR轴这一信号途径直接作用于SPB基因。而且，RA还可以通过增强mRNA的稳定性、减慢降解速率来提高mRNA的水平12。而具有强烈致炎效应的肿瘤坏死因子（TNF）可降低人肺腺癌细胞系中SPB mRNA水平，具有效量依赖关系。TNF的抑制性作用与经蛋白激酶C依赖通路的作用一致。有文献报道，TNF对SPB mRNA表达的抑制是通过基因3端非翻译区的顺式作用序列介导的13。 3.2 SPB基因突变 Nogee发现新生儿SPB减少或缺失不仅与肺发育程度相关，也与基因结构变异有关8。SPB等位基因具有多态性，其突变率为百万分之三，某些特异位点突变可造成SPB蛋白合成障碍。通过采用基因克隆和DNA测序等基因分析技术，发现这些基因突变主要分布在SPB基因的前9个外显子上，以第2、4、7外显子分布尤甚，主要包括无义密码子、错义、移码和剪接位点突变。最常见的突变是1981年Teja K等首先发现的位于SFTPB第4外显子的 1549CGGA（121ins2）。这种突变的频率是1/1 0001/3 000，约70% SPB缺失病例与其有关8，15。这种突变导致移码并在第6外显子产生提前终止翻译的密码子，生成一种易变RNA转录物，使proSPB及成熟SPB缺乏，并引起SPC前体蛋白的不完全表达14，15。 然而，121ins2突变不是SPB缺失的唯一原因。近年来，许多学者对SPB基因突变进行了大量研究。目前已发现30多种引起部分或完全SPB缺失的隐性功能缺失性突变8，1422。Balland 等17发现在第7外显子上存在点突变（R236C）Arg236Cys（CGCTGC），这种突变没有影响转录或mRNA的稳定性，但降低了SPB的翻译效率和（或）改变了初始翻译产物的加工，从而使SPB含量减少。Nogee 等8通过对32个患SPB缺失婴儿的两对等位基因进行检测，发现了15种SPB基因突变。同时还发现第9外显子包含一些同源序列（CCCTG和TG A/G A/G G/T A/C），它们可能与一些小的插入和缺失有关。另一常见无义突变位于第4外显子g.1580，使第131密码子中异亮氨酸取代苏氨酸，清除5端糖基化位点23。Daniel J Wegner等24发现 SFTPB 中2958 bp缺失，即从g.3103（3端193bp到第6外显子完）到g.6061（5端 28 bp到第9外显子开始），是目前发现的遗传性SPB缺失中最大的缺失。 3.3 SPB 缺失发病机制 SFTPB基因突变既可能引起SPB mRNA的缺失，也可能生成异常SPB前体蛋白，使蛋白错误加工，从而影响活性SPB的生成25。而SPB或其proSPB调节维持PS内环境稳定的许多方面，包括处理proSPC、组装LB、形成TM、生成有效的PS薄膜及表面活性脂质和蛋白的再利用。SPB缺失导致PS结构异常、功能下降及LB结构的破坏26。用稳定的同位素标记PS前体研究发现，在体外和患病婴儿中磷酯酰胆碱（phosphatidyl choline，PC）组分及合成是正常的26，PG减少，L/S1.5）。电镜下SPB缺失的动物肺泡型上皮细胞完全缺乏LB，这是由于缺乏SPB而导致不能包装PS磷脂成为同心性板层结构所致27。SPB是肺泡型上皮细胞正常组装合成表面活性脂质和 SPC所必需，在SPB缺失时，SPC不能被处理转变为活性形式。proSPC 形成的6 kDa产物保留了proSPC肽氨基末端侧面12个氨基酸，说明proSPC在处理过程中最后的分裂没有发生，不能生成成熟SPC，最终导致功能性LB缺乏28。这种未处理proSPC在体外抑制PS功能并可能由于SPB缺乏而导致PS功能障碍。因此，SPB缺乏患儿呼吸衰竭也可能是多因素的，如上述PS磷脂及蛋白的异常加工和分泌、LB缺乏、SPC缺乏等，而不仅仅是因为缺乏 SPB。 3.4 SPB缺失临床病理特点 1993年报道了第1例家族遗传性SPB缺失，该家族中有3个临床特征相似的患儿，均为足月儿，都迅速发展成了严重的呼吸衰竭，其临床及X线摄片均与早产儿NRDS相似。随后的大量研究显示，SPB缺乏是一种常染色体隐性遗传病，通常发生在足月儿，其生后不久即出现严重的、持续的、进行性的呼吸窘迫，一般在生后12 h内。胸片表现为弥漫性肺泡浸润、肺泡塌陷、网状颗粒浸润和支气管充气影。大多都有类似家族史。尽管给予氧气和辅助通气、PS替代和（或）体外膜式人工氧合法（ECMO）等治疗，大多数患儿仍在出生后第1周或第1月内死亡。PS替代疗法无效，患儿通常没有或只有短暂性的治疗反应。目前，肺移植是其唯一选择。也有人提出基因疗法，但目前尚没有具体研究报道。 最初发现的SPB缺失患儿组织学表现为肺泡蛋白沉积症。但随着对更多患儿的研究发现，并不是所有的患儿都有明显的肺泡蛋白沉积症表现。一些121ins2纯合子突变SPB缺失患儿肺移植时组织学表现为巨噬细胞堆积，更像典型的脱屑性间质肺炎，仅有很少病例表现为肺泡蛋白沉积症29。在尸检或活检时发现肺部明显的组织学异常，表现为弥漫性肺泡和支气管损害、肺膨胀不全、透明膜、间质性肥厚、型细胞肥大及肺泡巨噬细胞和蛋白在肺泡堆积。 气管吸出物标本用ELISA或免疫印迹法分析，存在SPB免疫反应（目前仅限于对真空吸引分娩的研究），说明该婴儿不可能是遗传性SPB缺失。如果该标本中未测到SPB，而是存在6 kDa的未完全处理的proSPC，则要高度怀疑SPB缺失。然而，SPB缺失只有当基因组DNA序列分析中检测到突变时才能确诊。应与PS生成不足、ABCA3缺乏、全身或局部感染、肺静脉回流梗阻引起的心脏疾病及其他原因引起的肺泡蛋白沉积症相鉴别。 综上，SPB在PS系统的结构、代谢及功能方面都有着重要作用。SPB缺失将导致新生儿致命性呼吸窘迫。对一些不明原因的致命性呼吸窘迫要考虑SPB缺失可能。对SPB缺失病因及治疗的研究可提高NRDS患儿的生存率及生命质量。【参考文献】 1 Floros J, Kala P. 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