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生物工程导论文献综述 生物071 200738895106 史晶晶1 前言 现在，生物工程已经发展成为一个新兴的工业部门。短短十年时间，分产品已经达到了应用阶段。 在医药工业方面。1977年，美国第一次用大肠杆菌发酵生产人的生长激素生长激素释放抑制素。1981年已经正式投放市场。1982年底，美国的基因技术公司和有名的利莱化学制品公司联合生产出人的胰岛素，今年可以供应国际市场。可望不久将供应市场的产品有乙肝炎疫苗、阿尔法型干扰素、伽马型干扰素、尿激酶等基因工程新药。这些新药给癌症、脑血栓、血友病、侏儒症等疾病患者带来了新的希望。其他用基因工程生产的免疫球蛋白、流感疫苗、小儿麻痹疫苗等也都已进入试制的最后阶段。单克隆抗体技术已经广泛应用在临床诊断、监测以及对疾病的进一步治疗上。在兽用药物方面。用基因工程生产猪、牛的幼畜腹泻疫苗也已经在荷兰正式投产。其他如猪、牛生长激素、牛干扰素，以及口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等多种疫苗已经进行试验性生产。在农业方面。正在研究用遗传工程的方法使小麦、水稻等农作物能够吸收空气中的氮，自行固氮。如果成功，就可以大幅度地提高单位面积产量，并且避免施用尿素等化肥所带来的环境污染和氮化物致癌等弊病。现在已经能够取出大豆上的固氮基因放到小麦、水稻根部细菌上去，但是还不能表达它的作用。这牵涉到一系列的基本理论问题，还没有突破。 在工业方面。可以用基因工程培养出特殊的“超级细菌”。这种细菌喜爱吸收某种金属，这样不用花大力气就能够探明矿藏，并且利用它来进行采矿。据统计，全世界每年用“超级细菌”浸出的铜高达20万吨。培养某种“超级细菌”还可以吸掉石油里某种杂质，相应减低石油产品的成本。在食品工业方面。国外应用遗传工程的发酵法和酶法已经生产了18种氨基酸，年产量达到30万吨。苏联用生物工程方法生产的单细胞蛋白，年产量达到120万吨。 在能源方面。目前正在研究能够再生的生物能源，如用基因工程培养特殊的细菌，把没有用的植物纤维素分解成葡萄糖，生产酒精，用来补充或替代石油。 生物工程作为一门新兴的工业，今天还处在方兴未艾的开发阶段，仍是它越来越引起人们的高度重视，相信它在人类的生活中将日益显示出巨大的作用。我国在这个领域里有一些基础，如果急起直追，到本世纪末是可以赶上世界水平的。2 各论2.1 基因工程基因丁程是指用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行切割、拼接，然后按照人们的意愿重新组合成重组体，再把重组体放回到宿主细胞内进行大量复制，并使遗传信息在新宿主细胞或个体中高效表达，最终获得基因产物。这种人工创造新生物并给与生物新功能的过程称为基因工程，或称为分子水平上的遗传工程。基因工程又称作DNA体外重组技术。这种DNA分子的新组合克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能。这是基因工程的最大的特点。【1】2.1.1番茄抗虫基因工程最早是美国Monsanto公司研究人员1987年报道的将BtKurstaki HDB缺失的CrylAd导人番茄，转基因植株对烟草天蛾、烟草夜蛾、番茄果蝇螟显示出了不同的抗性31。印度的Mandaokar A D等通过子叶外植体与农杆菌共培养，将基因转入番茄，PCR检测及Southern杂交分析证明，目的基因已被整合到番茄的基囚组中，抗性试验及酶联免疫分析结果显示，外源毒素水平可占总可溶性蛋白的004041，外源基因表达水平高的转基因植株对番茄螟虫的幼虫的致死率可达100，外源基因表达水平低的转基因植株对番茄螟虫幼虫也有不同程度的抗性14。同时T0代转基囚植株自交得到的Tl进行抗虫试验，结果表明，部分T。代对番茄螟虫仍具有较高的抗性。【2】2.1.2斑马鱼基因技术的发展用转基因斑马鱼检测环境有害化学物质地方法：为了充分利用斑马鱼和其他脊椎动物模型，降低整合位点的复杂性，减少嵌合体和提高转基因效率，最近，在转基因青鳟中报道了一种简捷的方法，即大范围核酸酶(I-Scel meganucIease)与侧翼携带大范围核酸酶(meganuclease)识别位点的转基因载体一并注入，该项技术可产生高达30的转基因效率、50的种系传递率和单拷贝或低拷贝数量的整合事件。【3】2.1.3 白菜基因工程研究现状大白菜高频植株再生体系的建立及遗传转化效率的不断提高，为其转基因研究奠定了坚实的基础。目前导入芸薹属作物的外源基因主要有：蛋白酶抑制剂基因H。40，病毒外壳蛋白基因、复制酶基因等口。J。这些目的基因的成功导入，为大白菜的遗传改良提供了有效的技术途径手段。但是到目前为止。还没有转基因大白菜品种应用到生产实践的实例。利用转基因大白菜材料育成生产上实际需要的栽培品种还有很大距离。【4】2.1.4冻蛋白基因抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是一类具有热滞效应和冰晶生长抑制效应的蛋白质，能以非线性形式降低水溶液的冰点。 2001年，尹明安等口钉克隆了胡萝卜AFP基因，并构建了其植物表达载体，为进一步利用其转化番茄、甜椒等作物奠定了实验基础。Huang等o将树状抗冻基因DAFP21转入拟南芥，转基因植株的抗冻性和对照植株相比提高了0633。王艳等将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因MPAFPl49转人烟草中，一1处理48 h，发现转基因烟草的相对电导率和表型明显优于野生型烟草。室温恢复试验验证表明，转基因烟草可存活并恢复生长，而野生型烟草受到了不可逆的低温冻害。【5】2.1.5酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及酿酒酵母rDNA片段的穿梭载体pScIKP，利用rDNA在酵母基因组上的多个同源重组位点整合到染色体上，并在PGK启动下持续表达通过表达盒两端的同尾酶酶切位点实现多基因共表达用该系统表达绿色木霉的2种纤维素酶基因内切葡聚糖酶e93和纤维二糖水解酶cbh2，测定酶活力和协同降解非结晶纤维素的能力，证明该载体能成功应用于多个外源基因共表达和多表达产物协同作用的研究，为构建可直接降解纤维素的酿酒酵母工程菌、实现纤维素资源的转化和利用奠定基础。【6】2.2 细胞工程细胞工程是捂应用黼胞奎物学和分子生物学的方法，通过类似与王程学的步骤，在绷胞整体水平浅细胞器永平上，按照入fn的意愿来改变细胞内的遗传物矮墩获攥耘型生物或物种绷胞产品的一门综合性科学技术f2j萁终为门独宠静学辩，虽然只套三四十年静历史，但它已经建立了自己的完熬理论体系，取霉了令人疆嚣豹发蓑成巢，魏鼗警娶，L、器官移植、觉隆羊、单克隆抗体等。【7】2.2.1 植物细胞工程基础研究植物细胞工程是以植物细胞全能性为理论基础，以植物组织与细胞培养为技术支持，在细胞和亚细胞水平对植物进行遗传操作，实现植物改良和利用，或获得植物来源的生物产品的科学技术。植物细胞工程具有科学和技术双重特征，经过多年的探索和发展，已成为当代生物科学中一个重要学科和现代生物技术的重要组成部分。2.2.2动物细胞工程制药的研究细胞融合是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于产生新的物种或品系及产生单克隆抗体等。其中淋巴细胞杂交瘤在国内已普遍开展，并培育了许多具有很高实用价值的杂交瘤细胞株系，它们能分泌产生在诊断和治疗病症方面发挥重要作用的单克隆抗体。如甲肝病毒单克隆抗体、抗人IgM单克隆抗体、肿瘤疫苗$等可用于治疗疾病；抗人结肠癌杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体、抗M-CSFR(巨噬细胞集落刺激因子受体）胞外区的单克隆抗体。【8】2.2.3 植物快繁技术植物快繁技术在发达国家和发展中国家均有商业化应用，FAO将植物快繁技术作为成本效益高效型技术向发展中国家推广。通过茎尖培养或利用组织培养技术结合物理、化学方法获得无毒苗，已成为植物细胞工程技术的重要方面。目前已至少在40多个属的植物中研究了种质超低温保存的方法(germplasm cryopreservation)，确定了超低温保存种质的遗传稳定性和技术有效性。【9】2.2.4 翰霍普金斯医学院细胞工程研究所发现高效率基因打靶方法约翰霍普金斯医学院的邹冀中博士，邹博士表示，针对基因打靶在人胚胎干细胞中效率极低的问题，尝试了多种新方法来改进这一技术。通过使用锌脂核酸酶，获得了高达80的基因打靶成功率。高效地建立了阵发性睡眠性血红蛋白尿疾病基因PlGA定点突变的干细胞克隆。这样的干细胞可以用来建立阵发性睡眠性血红蛋白尿疾病模型，研究PIGA是如何引起阵发性睡眠性血红蛋白尿疾病的。另一重要成果是首次展示了在人类诱导多能干细胞中可以定点修复或突变一个基因，解决了人类诱导多能干细胞未来用于干细胞治疗的一个重要技术环节。【10】2.2.5薯细胞悬浮培养与突变体筛选陈克贵等(1999)研究了悬浮培养中甘薯细胞的生长特性及其影响因素，结果表明悬浮培养中的细胞生长曲线均呈“S”型悬浮培养的最佳2。4一D浓度不同品种间有差异，南薯88为10 mgL，8 1294为25 mgL，最佳蔗糖浓度南薯88为30 gL，8 1294为15 gL，椰乳和酵母汁能明显促进南薯88的生长但椰乳对8 1294无效。谷氨酰胺、色氨酸和脯氨酸对甘薯悬浮细胞的生长无促进作用，葡萄糖则抑制其生长。【11】 2.3酶工程所有生物体在一定的条件下都能合成多种多样的酶，酶的生物合成受细胞内外许多因素的影响，研究酶的生物合成及其调节控制，对指导酶的生产以及阐明某些抗生素和药物的作用机制有重要意义。新酶的研究与开发，除采用常用技术外，还可借助基因组学和蛋白质组学的最新知识，借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术，目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。【12】2.3.1核酸类酶的研究与开发据研究报道，一种发夹型核酸类酶，可使爱滋病毒（012）在受感染细胞中的复制率降低#(3，在牛血清病毒（452）感染的蝙蝠肺细胞中也观察到核酸类酶抑制病毒复制的结果!这些研究表明，适宜的核酸类酶或经过人工修饰的核酸类酶可以阻断某些不良基因的表达，有可能发展成为基因治疗药物或治疗艾滋病等病毒性疾病的药物。【13】 2.3.2酶工程技术在蛋白资源高值化加工中的应用无溶剂酶法合成是一种替代传统溶剂介质体系的良好方法将氨基端被保护或没有被保护的氨基酸酯和氨基化合物进行混合就可以简单地获得液态或半液态共溶物在无溶剂体系中一系列冻干或固定化的丝氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶等蛋白酶都可以用来催化各种中性酸性及碱性氨基酸的合成现已利用包括噬热菌蛋白酶-胰凝乳蛋白酯酶木瓜蛋白酶等各种酶在微量水中甚至无溶剂条件下合成了酰胺二肽酰胺三肽合成反应在纯底物及盐的水合物或痕量水中进行通过超声或均质化处理使反应物完全接触在这种条件下肽的产率可达到8 7%【14】 2.3.3辣根过氧化物酶和酶的共固定化根据HRP的催化机制“，在其催化循环中，HRP需要H。0。将其活化为复合物I(HRP I)才能与还原性底物发生氧化还原反应。基于此，HRP可与很多产H。02的氧化酶共固定实现反应偶联。这种关联性目前正被广泛地用来制作生物传感器，测定相应氧化酶作用底物的浓度。【15】2.3.4微藻油脂制备生物柴油Li等Ho人曾报道利用ChloreUa protothecoids微藻油脂，在固定化的Candida sp脂肪酶催化下制备生物柴油，转化率达98，且该微藻的油脂含量达44一48(细胞干重)。借助基因工程和遗传工程技术手段及光照培养技术，培养繁衍能力强、油脂含量高、生长周期短的工程微藻，降低微藻生物柴油生产成本，比植物油脂生产生物柴油更具有商业竞争力。【16】 2.3.5以有机材料为载体固定多酚氧化酶Huseyin BekirYildiz等以甲基丙烯酸甲酯和2噻吩甲基丙烯酸甲酯共聚物和吡啶为载体固定化多酚氧化酶，实验研究了按不同比例混合的共聚物作为固定化载体的影响。研究结果表明，酶固定化后，Km、Vm值都有较大的变化，呈现甲基丙烯酸甲酯比例越小，Km越小，Vm越大，固定化酶的最适pH则以甲基丙烯酸甲酯比例越大而向碱性移动。而且所得到的固定化酶的重复使用性较好，重复使用40次后仍保持了80的酶活性。【17】 2.4 发酵工程2.4.1发酵工程及其在生物农药生产中的应用发酵工程一般是指利用微生物的特定性状，通过现代化工程技术，在生物反应器中生产有用物质的一种技术系统。目前医用抗生素、农用抗生素等已有近200个品种，绝大部分都是发酵的产品，除抗生素外，发酵工程产品还包括氨基酸、酶等。在生物农药生产中发酵技术可以大大提高生物农药的产量、质量和效益。利用发酵工程技术研究农用抗生素发酵代谢规律，可望获得大幅度提高发酵水平的新型工艺。【18】 2.4.2发酵法生产番茄红素oMsMolina等通过遗传修饰破坏卷枝毛霉(Mucor circineUoides)MU202中的crgA基因(编码胡萝卜素形成的负调控蛋白)，进而得到组合菌株MU224使番茄红素含量达到5mgg，较出发菌株MU202增加了7倍，在摇瓶中培养番茄红素产量达54 ingL。【19】 2.4.3秸秆降解菌株的筛选及其发酵从发霉的秸秆、毛巾以及土壤等纤维素含量较高的样品中筛选得到高效降解木质纤维素的微生物，并对所筛菌株产纤维素酶情况进行比较，获得目的菌株，研究得到NSSF比SSF的乙醇产量高。但是NSSF操作复杂，耗时耗能，相比较SSF更适合大规模生产，所以关键是要找到更好的降解菌株，减少同乙醇发酵菌种竞争，同时避免形成抑制物。【20】3 展望生物制药作为生物工程研究开发和应用中最活跃、进展最快的领域，被公认为是%!世纪最有前途的产业之一。生物技术是令人瞩目的高新技术，为人类解决疾病防治、人口膨胀等一系列问题带来了希望。目前生物新技术的研究取得重大突破，产生大量有益于人类健康的生物医药产品。可以预测申报、临床试验、使用的生物技术新药将会越来越多，生物工程制药产业不仅将成为利润丰富的支柱产业，也将为人类健康提供更多更好的保障。【21】参考文献【1】宋宁宁，侯文秀，许向阳. 基因工程在番茄育种中的应用，东北农业大学学报，2009（5）：123128【2】Mandaokar A D.Goyal R K.Shukla A Transgeni c tomato plants resistant to fruit borer(Helicouerpaarmgera Hubner)2000(05)【3】吴玉萍，熊茜，张广献，徐安龙. 斑马鱼基因工程的研究进展，遗传学报Acta Genetica Sinica，October 2004，31(10)：1167117【4】张传坤，陈立群，张青. 大白菜基因工程研究进展，安徽农业科学，Journal ofAnhui A鲥Sci2009，37(25)：1187411876【5】陈儒钢，巩振辉，逯明辉，李大伟，黄炜. 植物抗寒基因工程研究进展，西北植物学报，2008，28(6)：12741280【6】龚映雪，台艳，肖文娟，王峻梅. 酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用，深圳大学学报理工版，2010，27(1)：8287【7】差焦霞，李禳莲. 生物技术专业细胞工程课程建设与改革，科技创新导报，2008（9）：245246【8】李刚，刘鹏，刘诚迅，王钊. 我国细胞工程制药的研究现状和发展前景，中国现代应用药学，2002，19(4)：278281【9】汪勋清，刘录祥.植物细胞工程研究应用与展望. 核农学报2008，22(5)：635639【10】学科新闻：翰霍普金斯医学院细胞工程研究所发现高效率基因打靶方法，中国组织工程研究与临床康复，ssN6738225【11】陈明灿，覃德华，李友军，孔祥生. 甘