大豆异黄酮及其在保健食品中的应用.doc

大豆异黄酮及其在保健食品中的应用大豆异黄酮（isoflavoens）是一组存在于豆科植物的多酚类生物活性物质，因其结构与雌激素相似，表现出雌激素与抗雌激素活性，因此又被称作植物雌激素(phytoestrogen)。 自20世纪90年代以来，大量的流行病学、人体和动物实验的研究结果表明，大豆异黄酮具有多种特殊的生理功能。其类似雌激素样作用对绝经期后妇女因雌激素水平下降所导致的骨质疏松、更年期综合征、血脂升高等有很好的预防效果；对激素依赖型肿瘤如乳腺癌、子宫癌、前列腺癌有一定的抑制作用；并具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、提高机体免疫力及美容的保健作用，其独特的保健作用及多种特殊的生理功能日益受到世人关注，是一类颇具开发利用价值的天然保健食品原料。1 大豆异黄酮概述大豆异黄酮主要存在于大豆、墨西哥小白豆、绿豆、苜蓿和葛根等植物中，其中含量最高的是苜蓿和大豆，一般苜蓿中含量为0.53.5%，大豆中含量为0.10.5%。大豆的品种及栽培条件对大豆异黄酮的含量影响很大，一般来说，纬度越高，日照时间越长，大豆异黄酮的含量也就越高。大豆异黄酮由12种单体组成，包括3种游离型的苷元：染料木苷元（或金雀异黄素，genistein）、大豆苷元（daidzein）、大豆黄素（glycetein），和9种结合型的-糖苷1-2。其中含量最多的是染料木苷元和大豆苷元的糖苷型结合物，即染料木苷（genistin）和大豆苷(daidzin)，二者约占大豆异黄酮总量的5095%3。大豆异黄酮制品一般为黄色至淡黄色粉末，较强的苦涩味，溶于水，耐热、耐酸，稳定性高。在水溶液中120加热30min后几乎不分解，于180加热30min后仍保留80%以上，在酸性PH=2时仍保持稳定，因此在用于食品加工时非常稳定。由于其口感不好，以前在食品加工中多被除去，现已开发出味微苦的大豆异黄酮制品。2 吸收与代谢游离型的苷元可在小肠被直接吸收，但大豆及其加工食品中的大豆异黄酮多数是以糖苷结合物的形式存在的，并不是可以被人体吸收利用的形式，它们通过小肠刷状缘分泌的-葡萄糖苷酶水解后被吸收（Wilkinson et al.2003;Rowland et al.2003），在血液中与葡萄糖醛酸和少量的硫酸结合发挥生物活性。没有被吸收的大豆异黄酮会在结肠被肠道微生物降解为雌马酚（equol）和去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin），然后进一步被肠道吸收。这一过程很难进行证明，但有利于我们理解功能性食品中大豆异黄酮是如何发挥生物学活性的4。影响大豆异黄酮代谢的因素包括膳食和肠道微生物5，人体试验证明，饮食中较高的膳食纤维会降低大豆异黄酮的生物利用度。肠内乳杆菌等益生菌含量高的有利于大豆异黄酮的生物利用。一般大豆异黄酮在人体内的生物利用率为1335%。3 检测方法高效液相色谱法（HPLC）法是检测大豆异黄酮含量准确、快捷的方法。染料木苷（genistin）和大豆苷(daidzin)占大豆异黄酮总量的5095%，一般以染料木苷或大豆苷为标准样品，采用C18柱分离，二极管阵列检测器或紫外检测器（254nm或260nm）测定，峰面积定量，外标法计算结果。HPLC法因选用的色谱柱、流动相不同，最佳色谱条件应根据具体情况调整。采用VP-ODS柱的最佳色谱条件为：内径 4.6nm，长 150mm，流动相 V甲醇：V乙酸：V水（40：0.5：60），流速 1.5ml/min，柱温 40，检测波长 254nm（王哲等，2003年）。采用日本岛津Shim-Pack CLC ODS柱的色谱条件为：内径 6nm，长 150mm，流动相 V甲醇：V乙酸：V水（30：3.5：66.5），流速 1.01.5ml/min，柱温 50，检测波长 254nm（江和源等，2000年）。样品的前处理一般用甲醇或50%乙醇溶解，超声提取30min，经0.45m滤膜过滤后、定容、离心，取上清液进行液相色谱分析。4 生产工艺主要以大豆子叶、脱脂豆粕、制作豆腐时分离出的黄水及浓缩大豆蛋白的醇乳清为原料提取而得。虽然大豆胚芽中大豆异黄酮含量更高，但主要为大豆苷，其生物活性不如染料木苷及其苷元，且大豆胚芽中大豆蛋白很少，除大豆异黄酮外其余物质不明，市场售价比从豆粕中提取的异黄酮价格低很多，故市场前景不被看好。原料首先经乙醇等极性有机溶剂抽提、加热、分离溶出液得粗制品，进一步的提取、分离、浓缩主要有以下3种方法：（一）经液相色谱柱洗脱或经超滤膜过滤分离，再经冷却、结晶得较高浓度的异黄酮结晶物。（二）树脂吸附法 一般方法为将粗品的溶出液用树脂吸附，再用水洗净树脂、去掉杂质，经醇溶剂溶出一定浓度的异黄酮液，减压回收溶剂后，再经浓缩、真空干燥可得大豆异黄酮制品。各种改良的树脂吸附法可得到高纯度的异黄酮制品：有研究报道，使粗制品流经一个极性很高的阴离子树脂柱（含硫酸根功能集团），选择性地吸附7-葡萄糖基-异黄酮（7-glycosyl-isoflavone），而不吸附其他杂质，然后采用酸性溶液进行洗脱，即可制得异黄酮浓缩物6。还可利用树脂吸附法分离、制取游离型大豆异黄酮，首先用OPS树脂吸附醇乳清中的乙酰基异黄酮，用醇溶液洗脱，再经70以上加热处理，可制得结合型异黄酮糖苷，最后经酸或-葡萄糖苷酶酶解，可得到大豆异黄酮苷元。（三）利用大豆异黄酮溶解率随温度不同而变化的特性进行分离、浓缩：首先加热原料液到恒定的6595，经超率膜过滤，所得渗透液从85逐渐冷却至22之后结晶、离心、干燥，即可得大豆异黄酮制品。由于甲醇对人体有害，现在用甲醇提取大豆异黄酮的工艺已很少应用。大豆异黄酮制品的成型工艺主要有制片、制粉、胶囊和口服液，市场上已存在大豆异黄酮含量80%的产品，国外参考价格为13.9/mg（高纯品，2000），国内参考价格为38万元/kg。据报道我国对大豆异黄酮产品的年需要量在1500吨左右，而目前国内生产能力仅为500吨，如何降低生产成本是开发这一市场潜力的关键所在。5摄入量与安全性由于东、西方饮食习惯的差异，特别是大豆及其制品在膳食中所占的比重不同，使亚洲人的大豆异黄酮每日摄入量远远超过美国和欧洲。许多学者估计亚洲人大豆异黄酮的平均摄入量为20-50mg/d(Adlercreutz et al. 1991; Nagata et al.1997; Chen et al. 1999)或者更高，达到102mg/d（Ho et al.2000）。其中日本居民的大豆异黄酮每日摄入量为60-90mg，Crown等（1993）经计算得出日本的大豆异黄酮摄入量为25-100mg/d。我国关于大豆异黄酮摄入量的研究报道较少，其中对中国农村妇女进行的大豆食品和大豆异黄酮摄入量的膳食调查表明：我国农村妇女平均每日摄入大豆食品（主要是豆腐）23.5g，约合大豆异黄酮8.9mg/d7，远远超过了西方国家的平均摄入水平。Marie J. 等（2003）通过对欧洲四国的VENUS数据库进行分析发现：爱尔兰、意大利、荷兰和英国的大豆异黄酮平均摄入量均低于1mg/d。Keinan-Boker（2002）认为欧洲近10个国家的大豆异黄酮摄入量均不足2 mg/d。美国绝经后白种妇女的大豆异黄酮摄入量也低于1mg/d。为了抑制癌症和预防骨质疏松，美国政府支持和鼓励美国人多吃大豆食品，建议每人每天吃20-30g大豆，即每天摄入大豆异黄酮100-150mg，美国FDA还正式批准了大豆异黄酮与健康关系的声明。大豆异黄酮的安全性很高，小鼠急性毒性试验每公斤体重口服5g大豆异黄酮，无死亡例。Ames试验阴性。但这并不代表人体可过高的摄入大豆异黄酮，它还存在一定的潜在风险。临床试验表明：给予患骨质疏松症的妇女600mg/d大豆异黄酮，会引起13.2%的妇女发生淋巴肉芽肿（Alexandersen et al. 2001）。按照每公斤体重16mg的剂量给予6位受试者口服染料木苷，其中1位出现II型白血球减少症（Busby et al. 2002）。其他的一些负面报道还包括过高的大豆异黄酮摄入可引起人体脂肪酶异常和低磷酸酯酶症。体外试验表明：染料木苷元能够导致造血单核细胞中DNA双螺旋链的断裂，但人体长期服用多大剂量的染料木苷元才会出现类似的作用还不十分清楚（Kulling et a. 1999）。一项关于每日摄入染料木苷300-600mg的安全性研究正在美国北卡罗莱纳大学进行中。综上所述，大豆异黄酮安全摄入量的上限值还难以确定。但一般认为每日摄入大豆异黄酮50mg（0.5-1.0mg/kg.bw）对于大部分人群是安全的。由此推论，按照2.0mg/kg.bw的量摄入大豆异黄酮（150mg/d）在临床上很可能是安全的，因为临床上对病人有好的监护措施，但这个剂量能不能有效地治疗骨质疏松则是另外一回事了8。6大豆异黄酮的保健作用6.1 预防骨质疏松随着年龄的增长，成人的骨质会逐渐流失，严重时会导致骨质单薄，骨骼脆弱，易折断，这种现象就是骨质疏松症，它是老年人的常见病，通常于五、六十岁时出现症状，特别是绝经期后的老年妇女由于卵巢功能下降，雌激素分泌减少，体内骨代谢平衡被打破，使骨吸收大于骨形成，更易发生骨质疏松。流行病学调查和大量的动物试验证明，大豆异黄酮对于预防骨质疏松、调节骨代谢具有一定的作用。1995年，作为世界卫生组织（WHO）心血管疾病及营养状况比较（CDAC）的调查研究中的一环，对夏威夷的广市至冲绳的70岁以上日本女性进行了大豆异黄酮摄取量与骨密度相关的病因学调查，结果显示骨密度高的群体其大豆异黄酮的摄入量也较高。对于摘除卵巢的骨质疏松症模型白鼠给予补充大豆异黄酮或大豆蛋白，可抑制骨量减少（Arjmandi et al. 1996, Draper et al. 1997, Ishida et al. 1998, Ishimi et al.1998）。崔洪斌等人报道，给予断乳大鼠不同剂量的大豆异黄酮：12.5mg/kg、25.0mg/kg、41.6mg/kg，均能提高大鼠的骨矿质含量和骨密度值，并有剂量反应关系9。高剂量组的骨形成和骨吸收指标均被抑制，但对骨吸收的抑制作用大于骨形成，说明其防治骨流失的机制可能是通过降低骨转换率实现的，这与王建华等（2002）的研究结果相一致。关于大豆异黄酮的人体试验报道不多，Potter等（1998）报道，给予绝经期后妇女高剂量的大豆异黄酮（90mg/kg），腰椎的骨密度及骨矿质含量均上升，低剂量组则没有这些效果；Alekel等对69名围绝经期妇女的膳食干预也发现了类似的结果。但Hsu等报道，健康绝经后妇女每日服用150mg大豆异黄酮，6个月后骨密度与基础值比较无明显改善。以上表明，对于大豆异黄酮治疗骨质疏松临床效果的观点并不一致，但可以肯定的是大豆异黄酮对骨质疏松的预防作用。大豆异黄酮预防骨质疏松的机制可能是多方面的：大豆异黄酮可以与骨上存在的-雌激素受体特异性的结合，发挥雌激素样作用，起到预防老年性骨质疏松的作用。但这种雌激素样作用很弱，其活性仅相当与雌激素活性的千分之一至十万分之一，因此，植物雌激素对骨代谢的调节作用可能不是激素的直接作用，而是通过一系列生长因子、细胞因子的调节机制发挥作用的。体外实验结果表明，大豆异黄酮通过增加骨细胞碱性磷酸酶活性、胶原合成及DNA含量来促进成骨细胞增殖10。染料木苷通过Ca离子信号通路激活钙调素或蛋白激酶，活化核酸内切酶来诱导破骨细胞的凋亡；还有报道染料木苷通过作用于-转化生长细胞因子来阻止破骨细胞蛋白质的合成，诱导破骨细胞凋亡，抑制骨吸收。随着研究的深入，人们还发现不同种类的大豆异黄酮对骨代谢的作用机制是不同的，Ishida等发现大豆苷元具有雌激素样抑制尿中骨吸收指标上升作用，而染料木苷元则没有这种效果。总之，大豆异黄酮是通过雌激素样作用及降低骨转换率来预防骨质疏松的，但具体的作用机制还不是很清楚。6.2 抗癌作用流行病学关于大豆异黄酮与癌症发生关系的调查结果还不一致。日本于1990-1999年的10年间对2万余名40-59岁妇女进行的队列研究表明，经常喝豆浆、摄入大豆异黄酮与乳腺癌的发生呈负相关关系11。对上海832例子宫内膜癌患者进行的病例对照研究中发现：经常吃大豆食品能降低患子宫内膜癌的风险12。另一项对97名亚裔美籍妇女的病例对照调查的结论是大豆的摄入量与乳腺癌的发生存在负相关关系13。Keinan等对1.5万余名49岁以上荷兰妇女进行为期5年的对列研究发现：大豆异黄酮的摄入量与乳腺癌患病风险间无明显关系。但在该调查样本中，较高的大豆异黄酮摄入量只有0.5mg/d。许多动物实验的研究结果表明大豆异黄酮可预防癌症的发生（Barnes et al. 1990; Hawrylewicz et al. 1995; Lamartniere et al. 1995; Fritz et al. 1998; Gotoh et al. 1998），但也有一些动物实验的结果是相反的。Allred等报道，在缺乏内源性雌激素的条件下，膳食中的大豆异黄酮能刺激小鼠体内乳腺癌细胞的增长。Hsieh等在给去卵巢、免疫损伤模型大鼠接种人类MCF-7型乳腺癌细胞时发现染料木苷元能促进癌细胞生长。但这些动物实验的设计与人体实际利用大豆异黄酮的情况有很大的不同：首先，大鼠在切除卵巢后，会完全丧失合成内源性雌激素的能力，这与绝经后妇女还保留部分合成雌激素能力的生理状况是不同的；其次，缺乏免疫反应的动物模型会改变大豆异黄酮对癌细胞的作用机制；最后MCF-7型乳腺癌细胞是一种高度选择性细胞，并不能完全代表人类的乳腺癌细胞8。大豆异黄酮抗癌作用的机制可能包括以下几个方面：1、大豆异黄酮具有双向调节雌激素活性作用，能选择性地与雌激素受体结合，从而减轻雌激素的促细胞增殖作用，降低与雌激素有关癌症的发病风险。2、染料木苷是一个专一而强力的酪氨酸蛋白激酶（PTK）活性抑制剂，而PTK的活性提高可能使正常细胞转化成失控肿瘤细胞。3、染料木苷通过稳定DNA-拓扑异构酶复合物来抑制该酶活性，在肿瘤细胞中，这种复合物的稳定化导致双链或单链DNA断裂，从而引起癌细胞生长抑制或死亡。4、抗氧化作用及通过控制细胞内信号传导系统来诱导细胞程序性死亡。6.3 抗氧化作用大豆异黄酮具抗氧化作用。体外试验证明，大豆异黄酮能阻止细胞膜脂的氧化及低密度脂蛋白（LDL）的氧化修饰，防止DNA的氧化损伤16。细胞膜脂的氧化损伤与LDL氧化修饰会导致动脉硬化及心血管疾病的发生。动物试验表明，喂饲高剂量的大豆能显著提高大鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶活性。Kawakami等进行的动物实验表明，喂饲大豆异黄酮的大鼠组血中过氧化脂质含量、胆固醇及甘油三酯含量明显降低，肝中及血中-生育酚水平明显高于对照组。研究者认为大豆异黄酮是通过抑制肝中还原辅酶CoA的活性来发挥上述作用的。梁纪伟等进行的大豆异黄酮对D-半乳糖致衰老模型小鼠抗氧化系统作用的实验研究表明，大豆异黄酮可使脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力升高，血清谷胱甘肽过氧化物酶活力升高，且明显降低血清脂质过氧化中间产物MDA含量。大豆异黄酮具有抗氧化作用的人体试验少有报道。研究表明，植物雌激素的抗氧化活性机制不是通过消除自由基实验的，而是通过稳定LDL结构，保持其完整性来起作用的，对其他抗氧化剂的抗氧化效果有增强作用。大豆异黄酮具抗氧化作用，可防止体内细胞膜氧化，降低动脉硬化的发生，由于其弱的雌激素作用，近年来被越来越多地用作雌激素替代品来治疗心血管疾病。6.4 减缓更年期症状女性进入更年期后，会出现一系列与雌激素水平下降有关的更年期症状，如面色潮红、情绪烦躁等，进入闭经期后，会出现阴道以及尿道粘膜萎缩引起的阴道炎症状，同时出现皮肤干燥等皮肤障碍。大豆异黄酮是雌激素受体的调节剂，具有激素和非激素化合物的双重特点，它具有内分泌调节作用，这种作用体现在下丘脑垂体生殖腺的轴系统。补充大豆异黄酮可减缓更年期症状，而且避免了补充雌激素的副作用。摄食大豆制品较多的亚洲妇女潮红的发生率为1857%，在欧洲绝经妇女当中，潮红的发生率在7080%之间。然而在评价大豆异黄酮对潮红及阴道细胞影响的临床研究中，结果以及结论是不定的。如Messina.M等的研究报道认为大豆食品或大豆异黄酮补充剂能有效减轻面色潮红等更年期症状；Krebs等人对19662004年Medline上大豆异黄酮相关文献进行了分析整理，结论是大豆异黄酮不能改善潮红以及其他更年期症状。这类研究中还观察到安慰剂也具有减缓作用，说明绝经症状的临床研究非常复杂，还需要在终点评价指标等方面有所突破才能得出比较确定的结论。6.5 其他作用动物试验表明，大豆异黄酮会影响雄性大鼠脑胆碱系统并能减缓与年龄有关的神经细胞损伤和认知的减退，提示大豆异黄酮对大脑和神经系统存在一定的影响。Kritz等进行的人体试验发现，每天服用110mg大豆异黄酮6个月后，治疗老年妇女在语言记忆、逻辑记忆和回忆等方面均有较大改善，表明大豆异黄酮对绝经后妇女的认知功能，特别是语言记忆的改善有促进作用。刘刚等报道了大豆异黄酮具有保持皮肤水分的作用18。此外，大豆异黄酮还具有降低血中胆固醇含量的功能。7大豆异黄酮在保健食品中的应用国际上已开发出多种形式、多种功能的大豆异黄酮保健食品，如将大豆异黄酮与钙或锌一起制成速溶颗粒，用于预防骨质疏松症。将大豆异黄酮与葡萄籽提取