WATERS公司的UPLC-TQD培训资料MS7校正.pptVIP

四极杆系统的校正 校正 硬件vs软件 硬件的校正是由原厂和维修工程师进行的 可以保证名义质量数的准度 对于某些应用 硬件校正是足够的 对于需要最高的质量准确度的情况 用户可以通过Masslynx软件进行软件校正 并将系统的质量校正变得更为精确 在识别未知物以及MRM和SIR分析时 确认选择了准确的质量数 这是非常有用的 校正中的可变因素 环境的改变温度或者湿度的改变随着时间变化而发生的电源变化改变了分辨率设置在仪器的校正范围内工作是非常重要的 如同您不愿意在定量曲线之外进行定量计算一样 您也不希望在您的质量数校正曲线之外工作 仪器的校正曲线 CalibrationCurves 一台三重四极杆的仪器需要有三种校正曲线 对于MS1和MS2 有六条校正曲线静态校正 Staticcalibration 可以使四极杆质量分析器准确地定位于感兴趣的特定质量数上 例如调谐 SIR和MRM 扫描校正 Scanningcalibration 保证在扫描采集中峰采集的质量数准确性 例如全扫描FullScan 扫描速度补偿 Scanspeedcompensationcalibration 当仪器快速扫描是 补偿系统中的 滞后时间 质谱仪的每一种校正都需要参考溶液 不过 MassLynx可以在一个步骤中执行所有必须的校正 校正步骤 每个参考溶液的质谱图都是已经采集好的 采集过的质谱图中的峰与储存于参考文件表格中的预期理论质量数相匹配 Amassspectrumofareferencesolutionisacquired ThepeaksintheacquiredspectrumarematchedagainstatableofexpectedtheoreticalmasseswhicharestoredinaReferenceFile 参考文件中的每一个峰与采集的质谱图中对应的峰相匹配 EachpeakintheReferenceFileismatchedtoacorrespondingpeakintheacquiredspectrumfile Acalibrationcurveiscreatedthat adjusts themassesoftheexperimantalspectralpeakstothetheoreticalmassesofpeaksaslistedinthereferencefile 一般注射泵TypicallyaSyringePumpcapableofdeliveringaslow steadyflowrateof5or10 L minisusedwithanInfusionKitconsistingofafusedsilicacapillarytubingwithappropriatefittings 参考溶液 ReferenceSolutions 参考溶液用于在一个宽mass范围内产生多离子 质谱仪可以在此范围内被校正 常用的参考溶液 PEG PPGNaI CsI NaI RbIHorseMyoglobin PolyAlanine在此章节的最后有一些常用的参考溶液的配制方法 参考文件ReferenceFile 参考文件中包括参考溶液产生的质谱峰的信息 Masslynx软件将在校正过程中对其进行搜索并匹配之 该文件既有mass m z 信息 也有这些峰预期的强度 强度信息在校正LC MS系统时 通常是不用的 参考文件置于Masslynx软件的Ref文件夹下 参比文件都是text文本文件 可以用Notepad写字板浏览之 参比文件必须具备一个 ref 的扩展名 MS校正的方式 从调谐页面进入 选择校正 仪器校正使用自动调谐中的校正功能对于SQD TQD 可以使用IntelliStart InstrumentSetup功能进行仪器校正 校正仪器CalibrateInstrument 校正窗口 校正的参考文件 ExamplesofCalibrationReferenceFiles Myo refMyo1500 refMyo1500n refMyoneg refMyotrp refPigb ref Naics refNaics1 refNaics2 refNaics3 refNaics4 refNaineg refNairb ref Pegh refPegh1000 refPegh2000 refpeghna refpeghnam refpeghnh4 refppghna refppghnh4 ref HorseMyoglobinandPig NaIwithCsorRb PEGorPPG CalibrationReferenceFilesAreStoredin C MASSLYNX REF Note Na 22 9898Cs 132 9054I 126 9045Na NaI 173Na NaI 2 322Na NaI 3 472 校正的参考文件 NaI参考溶液的特性 NaI基质的溶液有Na I的优势 并有单一同位素 系统不必区分来自于不同同位素的各组峰 solutionshavetheadvantageofsodiumandiodinebeingmonoisotopic Therearenosetsofmultiplepeaksfromdifferentisotopesthatthesystemhastodifferentiatebetween 使用NaI RbI溶液校正低于85amu 使用NaI CsI溶液校正低于133amu时 存在问题 Theremaybeaproblemwithcalibratingbelow85amuwithNaI RbIand133amuwithNaI CsI 完成了校正 在将所有的NaI清除出系统之前 可以看到ESP 的灵敏度降低 同时ESP 可以看到一系列Na的加合物YoumayseeadecreaseofsensitivityinnegativeESPandincreasedformationofsodiumadductsinpositiveESPrightafteryoucalibratetillalloftheNaIwashesoutofyoursystem NaI溶液生成的离子可以高达4000amu Magnifiedby450X Magnifiedby5X NaIRbI质谱图 PEG PPG参考溶液的特性 PEG PPG基质的溶液形成来源于不同同位素 主要是C 的多个峰 这些同位素峰组可以检查质谱仪的分辨率 PEG PPG溶液非常容易电离 PEG 或者PPG 的混合物可以在一个宽质量数范围内产生离子 高达2500 PEG PPG溶液产生的碎片可以用于形成离子低至50amu之下 PEG PPG可能变得很 粘稠 清洗出系统可能需要一些时间 在确定的条件下 PEG PPG溶液可以产生一系列的多电荷离子 也可以产生一系列的单电荷离子 这些系列可以交叠并导致在一定质量数范围内的校正困难 PEG1000质谱图实例 单电荷的铵加合物 双电荷的铵加合物 PEG1000和醋酸铵 马心肌红蛋白 Myoglobin PigB 参考溶液的特性 当分析蛋白和多肽时 质谱仪常常测定多电荷离子的m z 对于一些化合物 电荷状态可以轻易地多达50 当校正分析多电荷离子的四极杆系统时 校正通常是在能产生多电荷离子的校正溶液基础上进行的 Whencalibratingquadrupolesystemsthatareanalyzingmultiplychargedspecies thecalibrationisoftenperformedonareferencesolutionthatproducesmultiplychargedions 这类应用中的参考溶液的代表是马心肌红蛋白以及猪和 或牛血清蛋白 17 15 14 13 12 11 10 9 1885 18 16 19 20 21 22 23 24 多电荷化合物的质谱图 Mass校正概述 选择并准备参考溶液 referencesolution 设置针 泵 syringe pump 与正确的源 清除现有的任何软件校正 对质谱仪进行调谐 找到参考溶液最佳灵敏度的参数 检查Mass校正中用到的参数 开始mass校正步骤 必要时 查看并编辑校正 TheCalibration Uncal cal shouldbeablankcalibration nosoftwarecalibration whichyoucanloadin use File Open menuitem 未校正的参考文件UncalibratedReferenceFile 清除当前的校正 选择一个参考文件 质量分析器的设置 质谱仪的调谐 设置峰显示的参数 从校正范围内选择四个代表性的峰并输入到Mass一栏中 确认选择了计划校正范围的顶端和底端的质量数 Makesureyoucheckamassnearthetopandbottomofthemassrangeoverwhichyouplantocalibrate 对于每一个峰 设置范围 Span 大约为5 确认选择了质谱上信号最弱的峰 峰优化 针对四个峰 尽可能地优化毛细管和锥孔电压 记住针对一个峰的绝对优化条件也许会完全消除另一个峰 此处的目标是找出符合四个峰的条件 同时也要检查参考溶液中强度最大的峰 以此确认系统并未被饱和 编辑参考文件EditingtheReferenceFile 如果您不能找到某一个峰 它们可以通过在峰前面添加一个 而加以注释 在校正步骤中 将不使用此标示出的峰 确认保存了 File Save 参考文件 如果标识出了特定的峰 保存尤其重要 AutoCalCheckParameters 校正参数CalibrationParameters QuadMassMeasureParameters 开始校正采集StartCalibrationAcquisition 采集参数AcquisitionParameters 采集参数AcquisitionParameters AcquiringforCalibration Afteralltheparameters massrange runduration etc areentered ClickOKandyouwillreturntowindowshowntotheright ThisbringsyoubacktotheAutomaticCalibrationwindow showntotheright ClickOKtobeginacquisition MonitoringtheAcquisition 一旦校正采集开始 可以从此窗口监测校正过程 每当一个校正完成 每一阶段都会显示状态 pass fail 检查校正文件 如果你选择了 打印报告 PrintReport 选项 Masslynx将在校正完成后打印一份有所有校正的报告 检查报告 查看校正是怎样进行的 报告包括 采集的质谱图AcquiredSpectrum参考峰的质量数ReferencePeakMasses采集的峰与校正线之间的偏差 Deviationsoftheacquiredpeaksfromthecalibrationline 采集的谱图参比峰的质量数采集的峰与校正线之间的偏差 打印出的校正报告的实例 AcquisitionofSpectraforCalibration 针对每一个校正类型 质谱图都采集并存放在一个后缀是 raw的文件中 质谱文件名静态Static StaticMS1 StatMS1 rawStaticMS2 StatMS2 raw扫描Scanning ScanningMS1 ScnMS1 rawScanningMS2 ScnMS2 raw扫描速度补偿ScanSpeedCompensation ScanSpeedCompensationMS1 FastMS1 rawScanSpeedCompensationMS2 FastMS2 raw ScanningCalibration ScanSpeedCompensation 校正中采集的质谱图实例 对于静态校正 质谱图只采集每一个峰附近较小的质量范围 对于652峰 质谱图只测定648至657Da的范围 FromaStaticCalibration 校正质谱图 质量范围分辨率离子能量 慢和快的扫描速度 检查校正 回顾校正报告 回顾校正报告 查看曲线 选择校正类型 Static Scanning ScanSpeedCompensation 以及四极杆 MS1orMS2 2 可以用 BrowseIn 浏览选择相应的文件 3 点击 OK 随后出现校正报告 回顾校正文件 编辑校正 有时选择峰会出错 如此例所示 鼠标右键点击并托拽到感兴趣的峰上 可以编辑并手工选择正确的峰 编辑校正 选择了错误的峰 错误的峰取消选择 选择正确的峰 保存校正 校验校正 校正结果也可以被校验 Withthecalibrationthatistobeverifiedinplaceonthemassspectrometer usethesamesetupasthatusedforthecalibration 注意应该使用同样的分辨率和离子能量 从采集对话框中 选择 Acquire Verify 选项 并点击 OK VerifyingaCalibration Spectrawillbeacquiredandpeakmassescomparedagainstreferencefilemassesjustlikeinthecalibrationprocedure Themassdifferenceswillbereportedtoseehowgoodthecurrentcalibrationis Thespectraacquiredfortheverificationprocesswillbestoredusingslightlydifferentfilenames Static StaticMS1 StatMS1V rawStaticMS2 StatMS2V rawScanning ScanningMS1 ScnMS1V rawScanningMS2 ScnMS2V rawScanSpeedCompensation ScanSpeedCompensationMS1 FastMS1V rawScanSpeedCompensationMS2 FastMS2V raw 查看校正验证ReviewingaCalibrationVerification 需要时可以查看每种校正的验证 从Ifitisnecessarytoreviewthecurvesforeachtypeofverification thenfromthewindowmenu clickon Process VerificationFromFile and browsein theappropriatefile SimilartoreviewingacalibrationasshowninStep16b VerificationReport AThetopgraphshowsthepeaksfoundintheinfusedreferencesolution ThemiddlegraphshowstheReferenceFilepeaks Thelowergraphshowsthedifferencebetweenthemassfound acquiredusingthecalibratedsystem andthemassintheReferenceFile Themassdifferencesshouldbelessthan0 1amu 保存校正质谱图SavingCalibrationSpectra Thecalibrationspectrumdatafilesareoverwritteneverytimeacalibrationisperformed Saveormovethecalibrationdatafoldersoffintoanotherfolderforlateruseifneeded Forexample youcanload Uncal andpracticechangingthemassmeasureparameters Thenchoosethe RecalibrateFromFile optionandselectoneofyoursavedfiles AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration AutoTuneWizard Calibration CalibrateCheck PEG1000withAmmoniumAcetate SodiumIodideSolutionforPositiveIonElectrospray Prepareasolutionofsodiumiodideataconcentrationof 2 g L micrograms microliter 2mg mL in50 50propran 2 ol IPA waterwithnoadditionalacidorbuffer Addcesiumiodidetoaconcentrationof0 05 g L micrograms microliter 0 05mg mL Cesiumiodideistoobtainapeakatm z133 Cs Withoutthis thereisagapinthecalibrationfileof150amufromm z23 Na andthefirstclusteratm z173 whichleadstopoormasscalibrationinthismassrange DonotaddmoreCsIthansuggested asitcanresultinamorecomplexspectrumduetotheformationofNaCsIclusters Usereferencefile NAICS REF SodiumIodideSolutionforPositiveIonElectrospray Alternative Prepareasolutionofsodiumiodide asdescribedpreviously butinsteadofaddingcesiumiodide userubidiumiodideataconcentrationof0 05 g L micrograms microliter 0 05