酶促化学发光免疫检测技术总结.doc

本人在酶促化学发光免疫检测领域工作已经有4个年头了，期间不仅学习并从事了酶促化学发光免疫诊断试剂的开发，同时很幸运地受聘于天众达公司，学习了化学发光免疫检测仪器的开发、生产全过程。这意味着本人经过了多年的努力，对酶促化学发光免疫检测技术有了较高层次的了解和掌握。虽然酶促化学发光免疫检测技术应用于临床检验约有10年的历史，但是遗憾的是，目前国内缺乏专门针对这一技术领域的学术专著。大多数用户对酶促化学发光免疫检测技术的原理、特点、影响因素等缺乏全面系统的了解。再加上某些不负责任的厂家的不专业的技术支持，造成了许多模糊和错误的认识，导致了酶促化学发光免疫检测技术在国内临床的实际应用情况非常糟糕。使得酶促化学发光免疫检测技术的优越性无法在临床检验中得到充分发挥。经过多年的实践，本人深深体会到，只有真正做好技术支持工作，一个新检测技术才能普及推广，才能完全发挥其优越性，造福国民。因此，就有了下面本人多年来的总结试剂篇酶促化学发光免疫检测技术属于体外免疫分析检测技术范畴常用体外免疫分析技术有： 免疫比浊分析 放射免疫分析 酶联免疫分析 化学发光免疫分析 时间分辨荧光免疫分析 金标免疫分析化学发光免疫分析检测技术包括： 直接化学发光免疫分析检测技术 酶促化学发光免疫分析检测技术 电化学发光免疫分析检测技术化学发光（chemiluminescence）是指某些化学反应中发出可见光的现象。通常是氧化反应产生电子能级处于激发态的物质，后者通过跃迁释放能量产生光子，从而导致的发光现象，其特点为消耗发光剂，同时量子效率相对较底，通常，可以用于分析化学的化学发光系统的量子产率值在0.010.20之间。一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下三个条件：第一，反应中可提供足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因为前一反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光；第二，有有利的反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三，激发态分子具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移它的能量给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。因此，化学发光测定易受化学反应条件，如PH值、离子强度、溶液组成、温度等的影响，影响反应速率或任意一个量子效率的因素都会改变发光强度。化学发光免疫分析检测技术是把化学发光技术应用于体外免疫分析的一种检测技术。化学发光免疫分析检测技术按化学反应类型可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。酶促化学发光包括辣根过氧化物酶（HRP）系统、碱性磷酸酶（AP）系统、黄嘌呤氧化酶系统等。非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁-鲁米诺系统等。按发光持续时间分类，可分为闪光（Flash）检测分析系统和辉光（Glow）检测分析系统。闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统等。其检测分式一般采用原位进样（In Situ Injector）和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测两个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如碱性磷酸酶-AMPPD系统等，其信号检测无须原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域（坪区）任意点测量单位时间的发光强度。 闪光尖峰 辉光坪台区 积分法测量 速率法测量原位进样 时间闪光与辉光及其测量方式的差别发光信号国内从2001年开始出现许多的化学发光体外免疫分析试剂及化学发光免疫分析仪器的生产制造厂家，其中绝大部分的厂家采用是发光系统是辉光系统，包括辣根过氧化物酶（HRP）系统、碱性磷酸酶（AP）系统。因此，本人在天众达公司就职期间，主要接触的也是这两个系统，下面就这两个系统做分析总结鲁米诺鲁米诺（5-氨基-2，3-二氢-1，4-二杂氮萘二酮，也称3-氨基邻苯二甲酰肼）是最常见的化学发光试剂之一。在碱性溶液（pH=1011）中，鲁米诺被氧化成激发态的3-氨基邻苯二甲酸盐。该物质在化学反应过程中发出蓝光，最大发光波长为425nm。在通常情况下，鲁米诺与H2O2的化学发光反应相当缓慢和微弱的，但是，当某些催化剂存在时，如K2S2O8、NACLO、FE（II）盐、MN（II）盐、辣根过氧化物酶、微过氧化物酶等，反应速率和发光强度可以得到很大的提高。鲁米诺的化学发光量子效率与溶液中的pH值有密切的关系（见表1），pH=11附近时达到最大值，约为0.010.02通常以0.1mol/L pH8.6Tris缓冲液作底物液。要注意是:首先,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光，而在最后光强度测定中造成空白干扰，因而宜分别配制成2瓶试剂溶液，只在用前即刻混合;其次, HRP发光增强剂如某些酚试剂（如邻碘酚）或萤火虫荧光素酶可增强HRP催化鲁米诺氧化的反应和延长发光时间，提高发光敏感度。对于酶促免疫分析，过氧化物酶是最常见的标记物。国内的试剂厂家绝大多数用的是辣根过氧化物酶。一般认为，鲁米诺的化学发光机理如图：AMPPD （Dioxetane Phosphate）中文名为1，2-二氧环已烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点：反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。在通常情况下，这种化合物很稳定。但是，结果有碱性磷酸酶存在，Dioxetane Phosphate作为酶的底物会在酶的催化一脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体（AMP-D阴离子），其有2-30min的分解半衰期，发出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度达到高峰，15-60min内光强度保持相对稳定。 下面就国内绝大多数在用的两个系统：辣根过氧化物酶（HRP）-鲁米诺系统（下文叫系统I）；碱性磷酸酶（AP）-AMPPD系统（下文叫系统II），在临床实际应用中常常忽视的问题做一个总结。实验操作方面1，试剂盒平衡 实验准备阶段，要把试剂盒放到室温1530分钟以上，以保证试剂整体达到室温，并把各液体组分振匀待用； 如果有样品、标准品、酶浓缩液需要稀释，要事先配置好，平衡15分钟以上，使工作液（即稀释后液体）内蛋白质分子布朗运动充分才可以使用 稀释时，液体量要用排尽法，否则将造成结果不准确2，布板 按实验需要布板，最好能用本子记录下布板信息，标明日期等，以防实验项目太多或样本太多时搞混。 多项目同时实验时，要在各条板条上注明项目名称和条数顺序。 剩下的干净条子要和干燥剂一起用密封袋密封好，并在袋子上做好标示。 待一切准备完毕，要开始加样时，方可以取出板条。如果排好的板条，暂时不做实验，要把其反扣在干净的纸候用。3，加样 加样品和标准品时，每个浓度都要更换吸头。 要尽量保持吸头的干净，不能到处碰桌子、瓶子等等。 同一板实验，只能同一个人加样，否则会因为个人加样习惯差异造成分析上的困扰。 如果是手工洗板，不能用沾满洗液的手套进行加样操作，防止洗液滴入微孔内. 洗液的ph值，离子浓度等会影响到酶、底物的效价和活性。 加样品和标准品时加样手法采用贴壁不排尽法，加酶和底物（系统I底物分A、B液两种；系统II底物就一种）时加样手法采用悬壁不排尽法。 样品加样量的准确性直接影响到最终结果。4，振荡l 加完样品和酶，要放置到混匀器（即振荡器）上混匀1530秒（此步很重要，混匀是加快液体内的蛋白质分子布朗运动，使反应更充分），才可以放至指定温度进行温育。l 震荡器速度要从小慢慢调到大，切忌一下子调大造成微孔内液体飞溅5，洗板 先将反应板中的反应废液甩弃再将反应板放入洗板机进行洗板操作。 原因：在此发光免疫系统中，酶量是大大过量的，如果没把废液甩弃，直接用洗板机的清洗针头进行吸液操作，将易造成孔间污染，影响实验结果。 甩液时速度要快，否则容易造成高浓度的废液流入相邻的低浓度孔内，导致孔间交叉。 每孔洗液浸泡体积应达到微孔板的90%以上（原因：虽然反应体积只有150UL左右，但在加样过程中不可避免地会有少量的酶和样品溅或沾到微孔上半部分（约150U至300UL 的地方），此时需要用洗液把这些没有参加反应的液体清洗掉。）； 洗液液量不能太满，如果太满，容易溢出来，将造成高浓度的废液流溢入相邻的低浓度孔内，导致孔间交叉。 反复清洗5遍，每遍浸泡1520秒。 不同洗板机参数不一样。本科室洗板机（型号： ）设置：次数5次；时间： ；液量： 。 清洗5次后，把反应板放在干净的吸水纸上面拍干，每次在纸上拍的位置不能重复（也就是不能在同一位置拍板2次及2次以上）。 若科室内，与酶联法共用洗板机，换洗液瓶时，要记得冲洗管道。 拍板要拍干，不能有残余液体，不能有气泡，如果有气泡拍不掉，可以用干净的吸头轻轻捅破（切忌使劲刮孔壁和孔底），不同的孔内气泡要更换吸头（不能共用一个吸头，会造成孔间污染，影响结果）。6，加底物（主要针对系统I，系统II就底物就一种，直接就可以使用） 加底物A、B液时加样手法采用悬壁不排尽法。 底物A液、B液可以按1：1比例事先（4个小时内）混合好备用（混合液的储存瓶子要用深色的以便避光），也可以先加A液（白瓶），再加等体积B液（棕色瓶）。 如果试剂底物是25ULA液+25ULB液。因量少，悬避加样很难加，强烈建议先事先混合再使用。 计时开始于加第一孔B液（棕色瓶）时。 加完整板B液后，要轻轻用手振荡5秒，放入仪器暗仓避光，第5分钟开始测试（计时开始于加第一孔B液时）。7，实验完成后要及时把各个项目试剂盒相应地整理清楚，及时放入冰箱储存。8，如果加样速度不够快，强烈建议各个项目分开做，不要在同一个板上同时做多个项目。原因：如果在同一个板上同时做多个项目，加样速度不够快的话，会造成前面的项目时间过长的现象，因为不同项目反应时间不一样，造成分析上的困扰（抗原抗体的在任何温度下都可以结合，不同温度只是结合物量和稳定性的差别）。9，针对系统II：由于AMPPD对AP酶非常灵敏，所以在整个实验操作系统中，要注意外来AP 对实验的干扰，因此，需要注意： 配制洗液的的纯化水需预先煮沸，冷却待用，7天内有效。 加样器吸头应经过高压灭菌，并干燥保存。 在加底物过程中应避免加样器吸头与板孔或手指接触，以防止底物受到污染。一些需要向客户传达的原理及注意点1关于两次实验光子数差别太多的理论原理底物的发光原理是：A+BC*D其中A+B的反应是个吸能反应，C*是不稳定态物质（即激发态），C*在变成稳定态物质D的过程中会因放出能量而发光。发光分为闪烁光和辉光：闪烁光是瞬间光，每秒的信号量是在几乎同一个水平；辉光是累积光，后一秒的信号量是前面光子数的累积。本公司的化学发光系统是选用辉光型。光子数的多少与以下几个方面有重要关联： 免疫学反应中免疫结合物的量的多少：结合物少，则结合到酶就少，催化底物时发光量就少；结合物的多少与反应温度、反应时间有密切的关系； 标记酶的量、活性：温度、PH值、溶液离子浓度、电解度等都影响着酶的活性； 酶催化底物时的环境温度（能量的多少）：周围环境的温度越高则分子运动越激烈，A+B过程吸收的能量越多，激发态C*变成稳定态D过程种放出的能量也就越多，信号量就也越大。两次实验光子数差别是个系统误差，不影响临床诊断结果的判定：样品和标准品的剂量比例关系是始终保持一致的。如果出现光子数不成比例地、无规则地升高或降低，那就不是系统误差，而应该在偶然误差上找原因。2两点的定标原理：采用两点定标法时，只要带入两点标准品即可（前提是事先已经有6点定标的曲线），根据这次两定标点的光子数与定标曲线上这两点的光子数比值，画出这次实验的曲线。两点定标中，两个点的选择，有的试剂说明书上有写出哪两个浓度的点可以作为两点定标点。有的则没指明，那就选择距离参考范围最近的两个点。 3，质控物的概念质控物是对此次实验中的标准曲线进行跟踪，看曲线是否在控。质控物只对标准曲线上的6个标准浓度（或两点定标时的两点）的偶然误差进行跟踪，而无法对样本的偶然误差进行跟踪。4，免疫学分析上常用的有:直线方程(一元一次方程)、双对数方程、Log-Logit方程、样条方程、四参数方程同一条剂量反应曲线可以用不同的模式进行拟合,但其拟合程度的好坏不一,并不是拟合模式越复杂越好,试剂盒的种类不同,处理方法也可不同,因此必须对拟合优度进行评价灵敏度：所谓灵敏度，就是在确定的可信限内，测定方法的最小可测剂量。其定义是能与零剂量（Bo）具有统计学差别的最小剂量。精密度：精密度是评价随机误差的指标。指在一定条件下，用同一实验方法检测同一样品所得结果得重复性，即实验数据得重复性。实验数据得波动越小，说明数据得重复性越好，精密度也就越高。因此统计学中表征数据的波动性的标准差（表征离散范围参数），变异系数（表征离散程度参数）也就成为表征精密度的指标。精密度是直接和全面评价免疫分析方法的质量和寻找误差原因的最基本指标。临床有效性：是表示某项测定完成临床目的的程度，即临床符合率。通过大量的临床观察确定被测物质的正常值范围，统计正常值与异常值的交叉范围，统计诊断符合率（阳性率、阴性率、假阳性率、假阴性率）以此来评价试剂和方法等是否有效。仪器篇酶促化学发光免疫检测技术使用的检测仪器是化学发光免疫检测分析仪。分析仪主要包括传动系统、温育系统、散热系统、检测系统、软件分析系统等。其中最核心的是检测系统，它极大地影响了检测结果的准确性和精密度。国内大部分仪器厂家使用是光电倍增管（PMT）来显示检测系统。分析仪检测原理图如下：下面是厦门TZD公司应用软件操作简易流程及一些技巧细节一、先开发光仪器再开电脑二、点击桌面上的“化学发光应用软件” ，三、进入界面，点确定四、进入操作界面：1，在“工具”“项目及参数设置”中扫入项目条码。2，新建病历，编辑病人信息；3，按实际实验布局进行排版。要布清楚各个项目的标准品、样品，“保存当前板布局”（如果下次实验同个项目的布局完全一样，又没有输入病人名字的需要，那么就可以使用“调用历史板布局”功能来调入此次保存的模板进行使用）4，进行测试时，点击“开始测试”。5，测试完成后，点击“分析计算”，然后点击“保存记录”。6，点击打印本次实验的病人报告。7，如果要更改病人报告单格或结果，进入，点“