透明质酸的生产工艺.doc

基础研究资料生产工艺透明质酸的生产工艺凌沛学 主编 张天民 主审 .透明质酸. 北京：中国轻工业出版社透明质酸（HA）的生产工艺主要分为二大类,以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。透明质酸在动物组织中的分布较为广泛，几乎所有的动物组织中均含有透明质酸，只是含量不同。已从下列组织中分离出了透明质酸：结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料透明质酸含量的高低、数量的多少和易于取得的程度等成本因素，能够用于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌，在生长繁殖过程中，向胞外分泌以透明质酸为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中透明质酸以游离状态存在,易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（r）有差别。一、以雄鸡冠(roostercomb)为原料的生产工艺14（一）工艺路线（二）工艺过程1提取冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90，保温10min，冷却至50，用1mol/L氢氧化钠液调pH8.59.0,加入适量胰酶,4550保温酶解57h，酶解过程中维持pH8.59.0。2过滤将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。3.乙醇沉淀和粗品干燥取滤液,调pH6.06.5,将滤液加到3倍体积的95%乙醇中,反复倾倒3次,待纤维状沉淀充分上浮后,取出沉淀,用适量乙醇脱水35次,放入有五氧化二磷的真空干燥器内干燥,得透明质酸中间品。4氯仿处理将透明质酸中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中,溶解浓度为0.3%,溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调pH4.55.0,加入等体积的氯仿搅拌处理2次,静置分出水相。5酶解将水相用稀氢氧化钠溶液调pH7.5,加入适量链霉蛋白酶,37酶解24h。6络合沉淀酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。7解离将HA-CPC络合沉淀加入0.4mol/L氯化钠溶液中,搅拌解离510h。8过滤解离液先用硅藻土过滤至清,再用0.2m微孔滤膜精滤。9纯沉淀、真空干燥将滤液加至3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，五氧化二磷真空干燥，得HA精品。（三）工艺说明与讨论1对原料的预处理，鸡冠应洗净后冷冻储藏。也可用丙酮脱水处理或储存，这样可除去大部分脂肪等杂质，以利于后面的分离纯化，但成本加大。2鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对透明质酸的降解。磨成糊状后，可先用水提取，过滤除去鸡冠残渣得提取液，然后进行酶解除蛋白质；也可将水提取和蛋白酶水解同时进行。后者的提取效率高，几乎达到完全提取，但提取液中的杂质含量也较高。提取时，可在水中加入1%的氯化钠。加热至90可对原料有一定灭菌作用，并使蛋白质热变性，易被蛋白酶水解。所用的蛋白水解酶为胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等，不可用胃蛋白酶，因胃蛋白酶的最适pH值太低，易导致透明质酸的酸水解。公鸡冠中的透明质酸以与蛋白质结合状态存在，酶解的另一重要作用是切断透明质酸与蛋白质分子的结合。提取和酶解时，应注意防腐。3透明质酸的提取液粘度较大，过滤速度较慢，可采用先粗滤后精滤，并加纸浆、硅藻土或活性炭助滤。4醇沉淀是分离提纯透明质酸、肝素、硫酸软骨素等粘多糖最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用，每次醇沉淀操作，都使透明质酸的纯度有所提高。不同最终浓度的乙醇沉淀操作还可对不同r的透明质酸进行分级分离，在较低乙醇浓度下，低r的透明质酸不易被沉淀出来，r越高，越容易被沉淀。在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀透明质酸或其它粘多糖时，必须有盐的存在，一般为1%左右的氯化钠。沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态,纤维状透明质酸容易制备,形态疏松,易于脱水和真空干燥,缺点是使用时，溶解速度慢，若在常温下溶解成1%的水溶液，需要37d。制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺较复杂，但粉末状透明质酸溶解速度快，使用方便。5第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得透明质酸产品，可作为化妆品用保湿剂（参见第十章）。6上述产品透明质酸进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。7氯仿可使蛋白变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。氯仿处理的另一个重要的作用，是除去致炎物质。如细菌内毒素是一种脂多糖（lipopolysaccharide），其分子兼具脂溶性和水溶性，在进行氯仿处理时，聚集在氯仿和水的界面，利用这一性质可除去细菌内毒素。另外，加快搅拌速度，可提高氯仿在水中的分散度，极大地扩大氯仿和水的界面面积，提高去除细菌内毒素等致炎物质的效率。可反复多次进行氯仿处理。8在精制过程中，再一次使用蛋白水解酶进行酶解除蛋白质时。应选用活性较高的酶，因为酶本身是一种蛋白质，在保证酶的总活性单位的前提下，酶的总重量越少越好，这样可减少产品中的蛋白质杂质。9CPC络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性粘多糖（透明质酸、肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等）常用的方法之一，特点是纯化效率高、回收率高，可以从很低浓度的溶液中将透明质酸或其它酸性粘多糖沉淀出来。原理是，CPC为季铵盐，在水溶液中带正电荷；透明质酸或其它酸性粘多糖，在水溶液中带负电荷；在低盐浓度下，透明质酸与CPC络合沉淀，在高盐浓度下，HA-CPC络合物解离溶解。利用这一性质，可除去不能与CPC络合并沉淀的杂质。透明质酸与其它酸性粘多糖聚阴离子的电荷密度不同，与CPC络合生成沉淀时盐浓度可以不同，络合沉淀物解离所需的最低盐浓度也不同。使用CPC络合沉淀法，可实现透明质酸与肝素、硫酸软骨素等酸性粘多糖的分离。此原理与离子交换法有类似之处。除CPC外，也可使用溴化十六烷基吡啶（CPB），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等其它长链季铵盐。10透明质酸在干燥之前要充分脱水，否则有机溶剂挥发后，残存的水分过多，会导致被干燥的产品粘结，不易于干燥，干燥时间延长，干燥后产品变硬、变黄。脱水所用的溶剂为95%乙醇、无水乙醇、丙酮和甲醇，丙酮的沸点低，挥发性高，用丙酮脱水易于干燥，但干燥后的产品带有特殊气味。干燥的产品量较少时，可采用静止状态下，加五氧化二磷进行常温真空干燥；产品量较多时，可采用动态的真空干燥，温度控制在5065，不用五氧化二磷。二、以人脐带（humanumbilicalcord）为原料的生产工艺3,5,6（一）工艺路线（二）工艺过程1提取丙酮脱水脐带在提取前应通风挥发干丙酮，剪碎，加入蒸馏水中浸泡24h，用高速组织捣碎机打成细小碎块。用蒸馏水反复提取4次，第一次加水量为脱水脐带10倍，之后三次适量递减。合并提取液过滤得滤液。2氯仿处理滤液中加入10%量的氯化钠，搅拌使溶解。用稀盐酸调pH5.0,加入等体积的氯仿搅拌处理，静置，待分层后分出水相。同样再加氯仿处理一次，分出水相。3酶解用稀氢氧化钠调pH7.5,按水相体积加入0.4%量的链霉蛋白酶,置37保温酶解24h。4氯仿处理再用氯仿处理23次，分出水相。5乙醇沉淀加入3倍体积的95%乙醇沉淀出透明质酸。取出沉淀，重新溶解于0.1mol/L的氯化钠溶液中,再次用3倍体积95%乙醇沉淀。6脱水干燥分别用95%乙醇、丙酮脱水，五氧化二磷真空干燥得透明质酸精品。（三）工艺说明与讨论1对原料预处理，新生儿脐带剪下后，应尽量挤出里面血管中存留的血液，再放入丙酮中脱水保存。若在提取前发现脱水脐带血管中残存较多血凝快，应将血管剥离，以减少提取和纯化过程中的血色素污染。否则，产品带有颜色。2本工艺尽量采用温和条件，避免可能使透明质酸大分子降解的处理，如加热、强酸、强碱等。3实验发现，在高盐浓度下，有机溶剂可使大部分蛋白质变性，或被盐析沉淀出，或在乙醇沉淀后不再溶于水，这样可使提取液得到明显的纯化。4本工艺未使用氯化十六烷基吡啶（CPC）络合沉淀法进行纯化，所得产品纯度较低，可能混有其它多糖，蛋白质杂质含量也较高(0.6%0.8%)，但由于所用的原料为人脐带，所得透明质酸精品作为眼科手术用粘弹辅助剂时,引起抗原反应的可能性较小。三、以动物眼玻璃体为原料的制备工艺3,7,8（一）工艺路线（二）工艺过程1提取将冷冻的牛、猪或羊眼球解冻，剥出玻璃体，融化后离心，分出上清，加入1.5倍体积的丙酮沉淀。8h后离心，所得沉淀加入到1mol/L氯化钠溶液中，搅拌提取4h，离心。2除蛋白质上清液在低温下加入冷的5%三氯乙酸，搅匀，立即离心分出上清液，用5mol/L氢氧化钠溶液调pH值至中性。3粗品沉淀将中性上清液倒入2倍体积95%乙醇中，分出沉淀。4溶解、吸附除杂质将沉淀溶于0.1mol/L氯化钠溶液中，加入处理好的漂白土搅拌吸附2h，离心收集上清液。5络合沉淀向上清夜内加入等体积的1%CPB溶液，得HA-CPB沉淀。放置12h后离心，收集沉淀。6解离沉淀洗涤后于0.4mol/L氯化钠溶液中解离4h，抽滤。7沉淀、干燥：将滤液倒入3倍体积95%乙醇中，分出沉淀。沉淀经乙醇、丙酮脱水，放于有五氧化二磷的真空干燥器内干燥，得玻璃酸钠精品。（三）工艺说明与讨论1以动物眼玻璃体为原料制得的透明质酸，其质量较以雄鸡冠和人脐带为原料者差，相对分子质量Mr较小，一般不适于作注射剂使用。2吸附除杂质步骤，尚可选用类似吸附剂。天然矿物质吸附剂常因生产厂或同一厂批次不同在吸附性能上有差异，其预处理方法也很重要，要根据实际情况实验研究来确定具体操作方法。3CPB与CPC的性能基本相同，两者在透明质酸的生产中可相互代用。四、细菌发酵法生产工艺（一）工艺路线1012（二）工艺过程1）摇瓶种子液的培养取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液400ml的1L锥形瓶中，37培养1216h，光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中。培养液配方：蛋白胨10g、牛肉浸膏5g、酵母膏5g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.3g，加水溶解至1L，115灭菌30min。2）种子罐种子液的培养按摇瓶种子液的配方配制培养液100L，加入种子罐中，通蒸汽加热，115灭菌30min。冷却至37，用火焰接种法，将摇瓶种子液接种于种子罐中，通气量50L/min，搅拌120rpm，37培养1216h。光镜观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可待接种于发酵罐中。3）发酵按摇瓶种子液配方，将葡萄糖含量提高到5%，配制发酵培养液1000L，加入1.4m3发酵罐中,通入蒸汽加热,115灭菌30min。冷却至37后，将种子罐中的种子液通过移种管道移至发酵罐中，维持通气量500600L/min，搅拌转速120rpm，37发酵4046h。在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH6.57.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下,pH值下降很慢或不再下降时,即为发酵终点。4）下游分离纯化发酵结束,用三氯乙酸调pH4.04.5,板框过滤除菌体,滤液用稀氢氧化钠调pH6.06.5,加三倍体积95%乙醇,沉淀出透明质酸。沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，加入0.5%的活性炭，搅拌吸附1h。过滤，滤液在搅拌下,加入过量的1%CPC水溶液与滤液中的透明质酸发生络合沉淀,静置使沉淀下沉,虹吸出母液,加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀于发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜,过滤,滤液加三倍体积乙醇沉淀,沉淀用乙醇和丙酮脱水,用旋转式真空干燥器进行干燥,得透明质酸钠。（三）工艺说明与讨论1.早在1937年，Kendall等12就发现链球菌可产生透明质酸，许多人对此进行了研究。链球菌属的多种细菌具有荚膜(见图3-1和图3-2)，这种荚膜的主要成分就是透明质酸。链球菌在生长过程中，荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株在整个生长期都有荚膜，有的在对数生长期的前段产生，后段消失，或稳定期消失，有的根本不产生荚膜。进一步的研究发现这与菌种是否产生透明质酸酶有密切关系，事实上目前一部分商品透明质酸酶就是用链球菌发酵制得的，荚膜的消失是由于被酶解了。MacLennan13根据是否产生透明质酸和透明质酸酶，将具有荚膜的链球菌C组分为三类：1）只产生透明质酸，不产生透明质酸酶；2）透明质酸和透明质酸酶都产生；3）只产生透明质酸酶，不产生透明质酸。因此，透明质酸酶的产生对透明质酸的发酵非常不利，在菌种的筛选时，要注意观察判断菌种是否同时产生透明质酸酶。可产生透明质酸的链球菌多为A组和C组,A组中主要有酿脓链球菌等,由于致病性较强,较少用作菌种进行大规模发酵；C组致病性较弱，多采用此类菌，主要有兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。发酵生产透明质酸所用的菌种,一般是将产生透明质酸的链球菌进行诱变处理得到,诱变方法有紫外线照射,化学诱变剂处理等。Nimrod11和细谷14等，分别在专利中介绍了用N-甲基-亚硝基胍（N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG）,对兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)进行诱变处理的方法,经过几步诱变处理,筛选出荚膜大、透明质酸产率高，无透明质酸酶和溶血素的变异菌株。实验证明，经诱变处理的菌种的发酵产率高达67g/L，而且相对分子质量也有较大提高。除链球菌外,还有Pasteurellamultocida可产生透明质酸15。图3-1链球菌荚膜示意图早期对链球菌荚膜透明质酸的研究，主要是为了探索链球菌的荚膜组成和其作用1620及实验室少量制备21,22等。研究发现，荚膜对链球菌有重要的保护作用。由于透明质酸为动物体内广泛存在的物图3-2链球菌及其荚膜光镜照片图3-3透明质酸在链球菌中的合成路线ATP：腺苷三磷酸，ADP：腺苷二磷酸，UTP：尿苷三磷酸，UDP：尿苷二磷酸，NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，CoA：辅酶A，Ac：乙酰基，P：磷酸，PP：焦磷酸图3-4透明质酸的合成示意图1-6为合成HA的顺序质，无任何抗原性，以透明质酸和水为主要成分组成的荚膜，覆盖在菌体表面，使动物机体的免疫系统无法识别，免受攻击。以工业化生产为目的的发酵透明质酸研究始于80年代初期23,在借鉴前人对某些链球菌产生透明质酸荚膜这一重要发现,利用现代液体深层发酵技术和设备,对菌种、培养基、各种发酵参数条件进行了优化，并对细菌生物合成透明质酸的代谢过程进行了深入研究，阐明了透明质酸在菌体内的合成路线（见图3-3，图3-4），使发酵产率和透明质酸的r有了大幅度的提高，发酵法已成为透明质酸生产的主流工艺。2.链球菌的营养需求较高,通常需含血清12,16,24、小牛肉浸出液（vealinfusionbroth）22、脑心浸出液（brainheartinfusion）18等培养基，菌体才能较好地生长，但这类营养物质价格昂贵，作为一般试验研究可以，大规模生产中用其作为培养基，成本太高。所以在选择菌种时，要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。发酵生产透明质酸所用的培养基，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。其中酵母膏最常用，除了作为氮源外，还含有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸25，可以提高透明质酸的产率。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。其他还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，铁、锰、铜、锌等微量元素。3.链球菌属于兼性厌氧菌,有氧和无氧条件下，都可以生长。在透明质酸的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵，也有的采用厌氧发酵26,27。根据透明质酸在链球菌内的生物合成路线（见图3-3），有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是生成透明质酸的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖，所必需的物质。因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于透明质酸的合成。Swann等28报道,发酵液中氧含量高,可使葡萄糖的代谢转向菌体增殖,而透明质酸的合成减少;氧含量低时,菌体增殖减少,透明质酸的合成增加。除了合成透明质酸外，还有小分子有机酸，氧含量高时，产生较多的醋酸，反之，产生较多的乳酸。Nimrod等29用兽疫链球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920的一个变异菌株进行发酵,在厌氧条件下,透明质酸的产率为2g/L;在通气条件下,为46g/L。一般通气量为12vvm（pervolumeofmediumperminute）。在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，而在不同阶段采用不同的溶氧量，是提高发酵产率的有效手段之一。通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧,但转速过快可导致透明质酸的机械降解。在发酵罐上最好加一个溶氧传感器，可以在发酵过程中在线检测和控制发酵液的溶氧，并对整个发酵过程的溶氧进行自动纪录。4在透明质酸的发酵过程中，pH值是一个重要的因素，一般控制在6.08.5范围内,最好在7.0左右,低于6.0或高于8.5,会影响菌体生长,降低透明质酸的产率。pH值低于5.0或高于9.0,菌体生长和代谢很慢或停止。发酵过程中，菌体产生的醋酸和乳酸等小分子有机酸的总量要大于透明质酸，因此可使发酵液的pH值以0.010.15/min的速度降低，需用氢氧化钠或碳酸钠溶液进行中和，以维持适当的pH值。用高浓度的氢氧化钠溶液，无需高温灭菌可直接加入发酵液中。在发酵罐上安装一个在线的pH自动检测控制装置是很有必要的。5在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37。发酵温度一般为37，也有的采用35或33等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。在种子培养阶段和发酵的初期，37培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成透明质酸，提高透明质酸的产率和r。6药用级透明质酸的r要求较高，发酵法生产的透明质酸的平均r为14MDa，人们试图通过葡萄糖的代谢调控，来提高透明质酸的r。Kitchen等30发现从成纤维细胞（fibroblastcells）分离出的透明质酸合成酶的半衰期仅有24h，大约相当于一条透明质酸分子链的合成时间，于是推断：一个透明质酸分子的r或链长度，取决于合成它的合成酶在其生命期内可聚合前提物分子（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）的数量。根据这一理论，菌体过多的表达透明质酸合成酶，酶分子之间会竞争同一前提物资源，导致透明质酸r的降低。以上分析推断，为提高透明质酸的r可考虑采用的几个策略,这几个方面的组合，是提高透明质酸r的关键。1）延长透明质酸合成酶的生命期2）降低生物量的合成，以减轻前提物资源的竞争3）增加透明质酸合成的前提物资源4）提高细胞的能源效率（energyefficiency研究