实验二 过氧化氢酶Km值的测定.doc

实验二 过氧化氢酶Km值的测定课程名称：生物化学与分子生物学实验课 年级：2006 专业、层次：临床医学本科 授课教师：许成山职称：讲师 学时：3学时基本教材：自编生物化学与分子生物学实验指导教学目的与要求：1、巩固酶促反应有关参数的知识，加深理解Km值的定义；2、学习Hanes作图法测定Km值的原理和方法；3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。大体内容与时间安排：1、Km值的定义及求Km值的作图方法（林-贝氏作图法和Hanes作图法） 5min2、过氧化氢酶Km值测定的原理 5min3、过氧化氢酶Km值测定的注意事项 10min4、学生做实验 100min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、Hanes作图法求Km值2、过氧化氢酶Km值测定的原理3、滴定管的使用和滴定终点的判断难点：过氧化氢酶Km值测定的原理一、Km值的定义：（一）当酶促反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度即为Km值。（二）Km值是酶促反应的特征性常数。二、实验原理（一）双倒数作图法（林贝氏作图法）以1/S为横坐标，以1/V为纵坐标求Km值。（二）Hanes作图法 S/V为横坐标，以S为纵坐标求Km值。（三）过氧化氢酶Km值测定的原理1、H2O2在过氧化氢酶的作用下分解生成了H2O和O2；2H2O22H2O+O22、S=加入的H2O2的量；3、V=固定时间内反应掉的H2O2的量=加入H2O2的量剩余H2O2的量；4、剩余H2O2的量可通过KMnO4滴定测出：2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O三、实验操作l、血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。2、H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。3、反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。加入物(ml)12345H2O2(约0.08mol/L)0.501.001.502.002.50蒸馏水3.02.502.001.501.00 室温摇匀，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。四、计算1、 （式中：4为反应液量4ml）2、反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数剩余的H2O2 mmol数即：H2O2 mol浓度加入的毫升数KMnO4 0.004 mol/L消耗的KMnO4毫升数 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数）3、求Km值：下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：计算程序12345加人H2O2数0.501.001.502.002.50加人H2O2mmol=0.080.040.080.120.160.20底物浓度S=40.010.020.030.040.05酶作用后，KMnO4滴定ml1.353.706.409.8013.20剩余H2O2mmol=0.0045/20.01350.0370.0640.0980.132反应速度V=一0.02650.0430.0560.0620.068S/V=0.3770.4650.5360.6450.735按前述方法作图求得Km0.032mol/L。五、注意事项1、加入1:1000稀释血清0.5ml/瓶后保温准5分钟；2、硫酸的浓度较大，小心不要溅出!3、作图应该用坐标纸，标明有关参数4、滴定操作（1）使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞；（2）滴定管使用前还要润洗（加KMnO4至刻度线24ml处）；（3）使用时，不能左右推动活塞（要以环指顶住管壁，拇指、食指和中指控制流量；（4）加滴定液时，液面要稍高于0，尔后排除尖端气体；（5）读数时，视线要与液面凹陷最低点平行。六、实验结果列表