蛋白质含量和核酸含量的测定.ppt

蛋白质含量的测定方法 一 双缩脲法 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应 在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物其最大光吸收在540nm处 蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似 也能与Cu2 形成紫红色络合物 其颜色深浅与蛋白质浓度成正比 而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关 该法测定蛋白质的浓度范围适于1 10mg mL 双缩脲法常用于蛋白质的快速测定 仪器 试管及试管架 吸量管 分光光度计 分析天平 震荡机 刻度吸管 100ml具塞三角瓶 漏斗 试剂 双缩脲试剂1 标准蛋白溶液两种浓度的结晶牛血清白蛋白溶液 BSA 2 待测蛋白质溶液人血清 稀释适当倍数 使其浓度在标准曲线测试范围内 0 05mol L的NaOH溶液 二 凯氏定氮法 原理 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量 此法的结果称为粗蛋白质含量 由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物 如核酸 生物碱 含氮类脂 以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确 操作较为简单的方法之一 可用于所有动 食品的分析及各种加工食品的分析 可同时测定多个样品 故国内外应用较为普遍 是个经典分析方法 此法可应用于各类食品中蛋白含量测定 凯氏定氮法可分为全量法 微量法及经改进后的改良凯氏定氮法 目前通常以硫酸铜作催化剂的常量 半微量 微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少 且有一套微量凯氏定氮器 在凯氏法改良中主要的问题是 氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间 简化操作的问题 即分解试样所用的催化剂 常量改良定氮法在催化剂中增加了二氧化钦 仪器 凯氏烧瓶500ml 可调式电炉 蒸汽蒸馏装置 铰肉机 蓖孔径不超过4nm 组织捣碎机 粉碎机 研钵 玻璃或瓷质 化学消化器 凯氏定氮仪 空气滤过器 试剂 水为蒸馏水或同等纯度的水 硫酸铜 硫酸钾 浓硫酸 40 氢氧化钠溶液 硼酸溶液 0 1mol ml盐酸标准滴定液 甲基红次甲基蓝混合指示液 三 紫外吸收法 蛋白质分子中 酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键 使蛋白质具有吸收紫外光的性质 吸收高峰在280nm处 其吸光度 即光密度值 与蛋白质含量成正比 此外 蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比 利用一定波长下 蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系 可以进行蛋白质含量的测定 紫外吸收法简便 灵敏 快速 不消耗样品 测定后仍能回收使用 低浓度的盐 例如生化制备中常用的 NH4 2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定 特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测 因为此时只需测定蛋白质浓度的变化 而不需知道其绝对值 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差 干扰物质多 在用标准曲线法测定蛋白质含量时 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质 有一定的误差 故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 若样品中含有嘌呤 嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质 会出现较大的干扰 核酸的干扰可以通过查校正表 再进行计算的方法 加以适当的校正 但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的 虽然经过校正 测定的结果还是存在一定的误差 此外 进行紫外吸收法测定时 由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化 因此要注意溶液的pH值 测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致 仪器 紫外分光光度计 吸量管 试管和试管架 移液枪 试剂 1mg ml的牛蒡血清白蛋白溶液 浓度为1mg ml左右的蛋白溶液 四 酚试剂法 原理 Folin 酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成 在Folin 酚试剂法中 蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠 铜盐溶液 试剂A 起作用生成紫色络合物 类似双缩脲反应 由于蛋白质中酪氨酸 色氨酸的存在 该络合物在碱性条件下进而与试剂B 磷钼酸和磷钨酸 硫酸 溴等组成 形成蓝色复合物 其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比 通过比色测定 参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线 可确定待测样品的蛋白质含量 本法可测定蛋白质含量的范围在25 250 g mL 由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同 致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致 产生误差 如果所用溶液或样品中含有带 CO NH2 CH2 NH2 CS NH2 基团的化合物 或者溶液或样品中含有氨基酸 Tris 核酸 蔗糖 硫酸铵 巯基及酚类等化合物时 会给本方法的测定带来干扰 磷钼酸 磷钨酸试剂 Folin 酚试剂B 仅在酸性条件下稳定 而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行 因此当试剂B加入后应当立即充分混匀 以便在磷钼酸 磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应 这对于结果的重现性非常重要 仪器 v 1100分光光度计 恒温水浴箱 试管及试管架 加样枪及加样试架 坐标纸 试剂 200ug ml的牛血清白蛋白溶液 碱性硫酸铜 当日有效 Fu lin酚试剂 五 染料结合法 原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 是利用蛋白质 染料结合的原理 定量的测定微量蛋白浓度的快速 灵敏的方法 考马斯亮蓝G 250存在着两种不同的颜色形式 红色和蓝色 它和蛋白质通过范德华力结合 在一定蛋白质浓度范围内 蛋白质和染料结合符合比尔定律 Beer slaw 此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式 最大光吸收由465nm变成595nm 通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和染料结合是一个很快的过程 约2min即可反应完全 呈现最大光吸收 并可稳定1h 之后 蛋白质 染料复合物发生聚合并沉淀出来 蛋白质 染料复合物具有很高的消光系数 使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高 在测定溶液中含蛋白质5 L ml时就有0 275光吸收值的变化 比Lowry法灵敏4倍 比紫外吸收法灵敏10 20倍 测定范围为10 100 g蛋白质 微量测定法测定范围是1 10 g蛋白质 此反应重复性好 精确度高 线性关系好 标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲 这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠 试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低 但直线弯曲程度很轻 不影响测定 此方法干扰物少 研究表明 NaCl KCl MgCl2 乙醇 NH4 2SO4无干扰 强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰 这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响 Tris 乙酸 2 巯基乙醇 蔗糖 甘油 EDTA及微量的去污剂如TritonX 100 SDS 玻璃去污剂有少量颜色干扰 用适当的缓冲液对照很容易除掉 但是 大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除 仪器 721型分光光度计电子天平容量瓶移液管 试剂 标准牛血清蛋白溶液 称取牛血清蛋白10mg 溶于100ml蒸馏水中 浓度为100ug ml 染料试剂 称取考玛斯蓝G 250 CoomassidbrilliantblueG 250 60mg 溶于100ml13 过氯酸溶液中 滤去未溶解的染料 贮于棕色瓶中 核酸的测定方法 一 定磷法 原理 核酸分子中磷的含量比较接近和稳定 DNA的品均含磷量为9 9 RNA的品均含磷量为9 4 故可通过核算样品的含磷量计算出核酸的含量 仪器 试管及试管架 克氏烧瓶 小漏斗 容量瓶 吸量管 7222型分光光度计 电炉 水浴锅 试剂 标准磷溶液17 硫酸2 5 钼酸铵溶液10 抗坏血酸溶液 二 定糖法 原理 核酸中的戊糖在浓硫酸或浓盐酸作用下可脱水生成醛类化合物 醛类化合物与某些呈色剂生成有色化合物 可用比色法或分光光度法测定其溶液的吸收值 在一定浓度范围内 溶液的吸收值与核酸的含量成正比 二苯胺法 原理 脱氧核糖核酸中的2 脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应 在595nm处有最大吸收 DNA在40 400微克范围内 光密度与DNA的浓度成正比 在反应液中加入少量乙醛 可以提高反应灵敏度 除DNA外 脱氧木糖 阿拉伯糖也有同样反应 其它多数糖类 包括核糖在内 一般无此反应 DNA分子中的脱氧核糖基 在酸性溶液中变成 羟基 酮基戊醛 与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物 max 595nm 可用比色法测定 仪器 分析天平 恒温水浴锅 试管 吸量管 2毫升和5毫升 分光光度计 试剂 DNA标准溶液 须经定磷确定其纯度 取小牛胸腺DNA钠盐以5mmol L 1氢氧化钠溶液配成200微克 毫升的溶液 样品待测液 准确称取DNA干燥制品以5mmol L氢氧化钠溶液配成50 200微克 毫升的溶液 在测定RNA制品中的DNA含量时 要求RNA制品的每毫升待测液中至少含有20微克DNA 才能进行测定 二苯胺试剂 A液 称取1克重结晶二苯胺 溶于100毫升分析纯的冰乙酸中 再加入10毫升过氯酸 60 以上 混匀贮于棕色瓶中待用 B液 配制1 6 的乙醛液 临用前配制 临用时将A液20ml与B液0 1ml混合即得二苯胺试剂 地衣酚 苔黑酚 法 原理 RNA含量测定 除可用紫外吸收法及定磷法外 常用地衣酚法测定 其反应原理是 当RNA与浓盐酸共热时 即发生降解 形成的核糖继而转变成糠醛 后者与3 5 二羟基甲苯 地衣酚orcinol 反应 在Fe3 或Cu2 催化下 生成鲜绿色复合物 反应产物在670nm处有最大吸收 RNA浓度在20 250 g ml范围内 光吸收与RNA浓度成正比 地衣酚法特异性差 凡戊糖均有此反应 DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色 因此 测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量 仪器 分析天平 沸水浴锅 试管 吸量管 分光光度计 试剂 RNA标准溶液 须经定磷确定其纯度 取酵母RNA配成100微克 毫升的溶液 样品待测液 配成每毫升溶液含RNA干燥制品50 100微克 地衣酚试剂 先配0 1 三氯化铁的浓盐酸 分析纯 溶液 实验前用此溶液作为溶剂配成0 1 地衣酚溶液 三 紫外分光光度法 原理 在核酸分子中 由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系 因而具有独特的紫外线吸收光谱 一般在260nm左右有最大吸收峰 可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据根据核酸分子中的嘌呤和嘧啶环对波长260nm左右的紫外光有最大吸收的性质 可采用紫外分光光度法测定核酸的含量 1 g ml的DNA溶液的吸收值A260为0 020 1 g ml的