D核磁共振谱.ppt

第四章2D核磁共振谱 二维核磁共振谱的基本原理常用的2DNMR实验方法及用途结构解析 4 1 1二维核磁共振谱的基本原理 一维核磁共振 一个脉冲过后 就立即进行数据采集 得到FID 自由感应衰减 FreeInducedDecay 信号 它只是一个频率的函数 可表示为S F 二维核磁共振 一个脉冲过后 经过一段时间的延迟再进行下一个脉冲 才开始数据采集 这样会得到自旋核之间一些有用的信息 二维NMR实验的脉冲序列 预备期 preparation 演化期t1 evolution 混合期 m 检测期t2 dataacquisition 预备期 D1 使自旋体系恢复Boltzmann分布 处于初始热平衡状态 理论上应取D1 5T1 T1为纵向弛豫时间 但为节省时间 实验中一般取D1 2 3 T1 演化期t1 在预备期末 施加一个或多个90o脉冲 使系统建立非平衡状态 演化时间t1是以某固定增量 t1为单位 逐步延迟t1 每增加一个 t1 其对应的核磁信号的相位和幅值不同 混合期tm 由一组固定长度的脉冲和延迟组成 检测期t2 在检测期t2期间采集的FID信号是F2域的时间函数 二维核磁共振的关键是引入了第二个时间变量 演化期t1 当样品中核自旋被激发后 它以确定频率进动 并且这种进动行为将延续一段时间 表征这一特性的是横向弛豫时间T2 对液体来说 T2一般为几秒 通过检测期可以记录演化期t1内核自旋的行为 在演化期内从t1 0开始 用某个固定的时间增量 t1逐步延迟时间t1进行一系列实验 每一个 t1产生一个单独的FID 得到Ni个FID 这样获得的信号表示成两个时间变量t1和t2的函数S t1 t2 再经两次Fourier变换 一次对t1 一次对t2 得到以两个频率为函数的二维核磁共振谱S F1 F2 增加t1 t1 t2 预备期 演化期 混合期 检测期 FID的相位及振幅被t1调制也就等于谱图的相位及振幅被t1调制得函数S t1 t2 傅立叶转换对t2进行变换 FT t2 t2 t1 t1 f2 对t1进行第二次傅立叶转换就可以确定调制频率 得到以两个频率为函数的二维核磁共振谱S F1 F2 FT t1 f2 f2 f1 t1 4 1 22DNMR谱的分类 二维J分解谱二维相关谱COSY多量子谱 二维J分解谱 二维J分解谱一般不提供比一维NMR谱更多的信息 只是将谱峰的化学位移和偶合常数分别在两个不同的坐标轴上展开 便于解析复杂谱峰的偶合常数 二维相关谱 二维相关谱是在演化期t1中对某核进行标记 在混合期tm中把t1期间的相干传递给另一个核的相干 是通过J偶合作用传递的 以供t2期间的检测 二维相关谱是二维核磁共振谱的核心 它表明核磁共振信号的相关性 多量子谱 通常所测定的核磁共振谱为单量子跃迁 m 1 用特定的脉冲序列可以检测出多量子跃迁 得到多量子跃迁的二维核磁共振谱 4 1 3二维核磁共振谱的表现形式 堆积图等高线图断面图投影图 CHCl3的H H COSY谱 a 堆积图 b 等高线图 断面图 从二维图中取出某一个谱峰作垂直截面而表现出的谱图 这种图易于准确读取偶合常数 投影图 一维谱形式 相当于宽带质子去偶的氢谱 用来准确读取化学位移值 4 2二维J分解谱 2DJ ResolvedSpectroscopy 同核二维J分解氢谱异核二维J分解碳谱 4 2 1同核二维J分解氢谱 脉冲序列为 同核AX体系的自旋回波示意图 紫草素的部分1H NMR谱和二维J分解氢谱 断面图 化合物2的同核二维J分解氢谱 a 部分1H NMR谱 b 堆积图 c 投影图 d 断面图 用二维J分解氢谱有一个前提条件 即谱图必须属于一级谱 才能清楚地显示各峰形 某ABX体系的二维J分解氢谱 a 200MHz b 600MHz 4 2 2异核二维J分解碳谱 薄荷醇的异核二维J分解碳谱 4 3二维相关谱2DCOSYHomonuclearShiftCOrrelationSpectroscopY 氢 氢化学位移相关谱H H COSY氢 碳化学位移相关谱H C COSY二维接力相关谱2DRELAYED总相关谱 TOCSY谱 4 3 1氢 氢化学位移相关谱H H COSY 脉冲序列 ThebasicCOSY 45 or90 pulsesequence AX自旋体系的H H COSY90 示意图 交叉峰 对角峰 谷氨酸的H H COSY90o谱 500MHz 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 2 3 3 4 2DH H COSY45o谱 500MHz H2 H3 H2 H1 H2 H1 H2 H2 H3 H3 H4 H4 H4 H5 H5 H5 H6 H1 H2 H2 H3 3 PH COSY谱 相敏COSY PhaseSensitiveCOSY 通过相位的调节 将谱峰可能含有的吸收分量和色散分量调节为纯吸收信号 分辨率大为改善 使交叉峰的精细结构显现出来 便于读取化学位移和偶合常数 谱图特点 相敏COSY的对角峰为纯色散型 交叉峰是正负交替的纯吸收型 3J 8 00Hz AMX体系的相敏COSY谱的交叉峰 两个相位相反 一正一负 的圆圈之间的距离表示主动偶合常数 如JAX两个相位相同 同为正或同为负 的圆圈之间距离表示被动偶合常数 如JMX和JAM 2 3 二溴丙酸的相敏COSY谱 当有机化合物含有叔丁基 甲氧基等官能团或水时 其氢谱中出现强的尖锐单峰 在COSY谱中这些强的单峰会影响周围的弱峰 使它们变得更弱 甚至检测不到 磁等价的核间偶合不能产生多量子跃迁 叔丁基 甲氧基等官能团的质子是磁等价的 在谱图中只呈现单峰 水分子的两个质子也是磁等价的 通过DQF COSY实验 可滤掉这些磁等价的单峰或使它们变弱 DQF COSY谱 抑制强峰 含有叔丁基 甲氧基 溶剂峰改善峰形 在相敏COSY谱中 交叉峰为吸收型 分辨清楚 但其对角线峰为色散型 对角线旁的交叉峰侧易受干扰 DQF COSY谱中对角线峰和交叉峰均为纯吸收型 分辨率较高 有利于解析对角线附近的交叉峰 相敏COSY和DQF COSY的图形比较 2DGradientDQF COSY 5 LR COSY谱 远程H H COSY LongRang COSY 脉冲序列 在演化期和检测期前均加进一个固定延迟 0 2 0 5s 使演化期足够长 以便产生J值小的远程偶合的磁化转移 有效地传递弱偶合作用 化合物8的二维H H COSY谱和LR COSY谱 LR COSY LR COSY 4 3 2异核化学位移相关谱HETCOR Heteronuclearchemicalshiftcorrelation 1H 13CCOSY 1 C H COSY谱 氢碳化学位移相关谱 2 COLOC 远程氢碳化学位移相关谱 3 1H检测的异核化学位移相关谱 inverse实验 1 C H COSY谱 氢碳化学位移相关谱 F2域是宽带去偶的碳13C谱 F1域是氢谱谱图没有对角峰季碳不出交叉峰 基本脉冲序列 13C 1H t1 1 2 Thestandardpulsesequencefor13C detected1H 13Cchemicalshiftcorrelation AQ 化合物6的二维C H COSY谱 2 COLOC 远程氢碳化学位移相关谱 在C H COSY谱中季碳原子不出现相关峰确定分子骨架和推断结构很重要COLOC谱图形式类似于C H COSY谱 3 1H检测的异核化学位移相关谱 C H COSY和COLOC谱是对13C采样的 因13C核灵敏度比1H核低得多 测试样品多 累加时间长 把检测13C信号变为检测1H信号 将大大提高相关谱的灵敏度 1H检测的异核化学位移相关谱实验称为反转实验 inverse实验 包括 HMQC 1H检测的异核多量子相干实验 HSQC 1H检测的异核单量子相干实验 HMBC 1H检测的异核多键相干实验 1 HMQC HeteronuclearMultipleQuantumCoherence 薄荷醇的HMQC谱 2 HSQC HeteronuclearSingleQuantumCoherence HSQC与HMQC的谱图相同 都是显示1H核和与其直接相连的13C核的相关峰 其作用相应于C H COSY谱 HSQC与HMQC的比较 HSQC谱的F1域的分辨率比HMQC的高 HSQC谱的不足之处是脉冲序列比HMQC复杂 1 2 3 4 1 2 3 4 SensitivityEnhancedGradientHSQC 13C 1H t1 AQ C2 C3andC4 QuaternaryorprotonatedcarbonsX O N PulsesequenceforHMBC 用于季碳或自旋系统之间连接点的归属 对应于COLOC谱 3 HMBC HeteronuclearMultiple BondCorrelation HMBC与HMQC的区别 HMQC是通过异核多量子相干实验把1H核和与其直接相连的13C核关联起来 HMBC则是通过异核多量子相干实验把1H核和远程偶合的13C核关联了起来 其作用类似于COLOC谱 化合物9的HMBC谱 化合物10的HMBC谱 GradientHMBC 1 2 3 5 1 4 3 2 5 6 7 8 CDCl3 CDCl3 4 3 3二维接力相关谱 2DRelayedNMRSpectroscopy 常规的C H COSY和COLOC谱以及反转实验一般可以解决大部分有机分子的碳骨架连接问题 但有时候仍难以准确归属 二维接力相关谱是可以提供碳碳骨架信息有用方法 它是C H COSY谱的延伸它有两种实验方法 氢接力的C H COSY谱和氢接力的H H COSY谱 1 氢接力的H H COSY谱 H RelayedH H COSY 磁化矢量从HA转移到HB 再由HB转移到HC的接力 可检测出通过二根键 三根键和四根键连接的质子间的交叉峰 谷氨酸的氢接力H H COSY谱 p207 氢接力的C H COSY H RelayedC H COSY 磁化矢量从一个1H核 HA 磁化转移到邻位的另一个1H核 HB 上 再通过HB把磁化转移到与其相连的CB的磁化矢量上 称之HA HB CB接力 如果已确认了HA 就可以通过HA指认邻位CB的化学位移 4 5总相关谱 TOCSY谱 如果在氢接力H H COSY谱的脉冲序列中增加接力的级数 偶合相关的传递将逐渐增加 因此 从理论上讲 随着级数的不断增加 将显示自旋体系的全部相关峰 但接力级数增加 灵敏度下降很快 检测时间也会变得越来越长 限制了接力级数的增加 TOCSY谱就是通过特殊的脉冲序列 实现从一个氢核的谱峰出发 可以找到与它处于同一偶合体系的所有氢核的相关峰 TOCSY TOtalCorrelationSpectroscopY t1 MLEV17 AQ PulsesequenceforaTOCSYspectrum 不同的混合时间给出不同接力程度的TOCSY谱当混合时间很小时 TOCSY谱相当于COSY谱 COSY H Relayed COSY TOCSY 2DGradientTOCSY 混合时间10ms 相当于COSY谱 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 2 3 3 4 1 2 3 4 2DGradientTOCSY 混合时间20ms 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 2 3 3 4 1 3 2 4 相当Relayed COSY OH OH 1 2 1 3 1 2 3 4 2DGradientTOCSY 混合时间50ms 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 2 3 3 4 1 3 2 4 1 4 TOCSY OH OH 化合物6的TOCSY谱 4 4多量子二维核磁共振谱 2DINADEQUATE实验 确定13C 13C连接 1H检测的2DINEPT INADEQUATE实验 4 4 12DINADEQUATE实验 二维INADEQUATE实验是目前13C谱归属的最有效的方法 但由于13C的天然丰度只有1 1 两个核相连的几率只有万分之一 使INADEQUATE实验的灵敏度很低 即使样品浓度很大 100mg以上 实验累加时间仍然很长 2天 二维INADEQUATE谱有两种形式 第一种形式F2域为碳原子的化学位移 F1域为双量子跃迁频率 相互偶合的两个碳原子作为一对双峰排列在平行与F2域的同一水平线上 另一种形式是F1与F2域皆为13C的化学位移 谱图类似于H H COSY谱 但无对角峰 1 丁醇的2DINADEQUATE实验 薄荷醇的2DINADEQUATE谱 4 4 21H检测的2DINEPT INADEQUATE实验 2DINADEQUATE谱因灵敏度低 样品浓度大 实验累加时间长等缺点 使其应用受到很大限制 近年来 以INADEQUATE为基础发展了一些新实验方法 以提高灵敏度 如通过极化转移和检测1H的方法 使灵敏度有较大提高的2DINEPT INADEQUATE实验 INADEQUATE谱的最大优点 谱图无对角线峰 不存在对角峰掩盖邻近的交叉峰的问题 图面干净 薄荷醇的1H检测的2DINEPT INADEQUATE谱 2DNOESY NuclearOverhauserEnhancementsSpectroscopY t1 m AQ TheNOESYpulsesequence C C Ha Hb V C r 6 r 0 5nm r 0 5nm 主要用于谱峰归属 结构的确定 立体构型及构象研究 3 CH3 5 H GradientNOESY NOESY用于多肽序列的归属 2 3 H1 2 3 1 3 2 1 NH NH H H Spin lock 90 t1 t2 2DROESY实验脉冲序列 NOESY谱峰强度与分子在溶液中的相关时间 c有关 对于 c 1 0 0为Lamar进动频率 即分子量较小的分子 NOE的强度降至零 此时可用ROESY实验代替NOESY