牛奶和乳制品中唾液酸的测定.doc

药物分析：姓名：朱文鹏 学号：08301010021文章出自：Vronique Spichtig, Julien Michaud, Sean Austin，Determination of sialic acids in milks and milk-based products，Analytical Biochemistry 405 (2010) 2840牛奶和乳制品中唾液酸的测定作者：Vronique Spichtig, Julien Michaud, Sean Austin摘要：唾液酸被认为是婴儿牛奶，儿童牛奶和乳制品中的重要成分之一。因此，许多公司都将唾液酸列为其产品成分。为核实其真实性，需要合适的方法进行分析。这项研究的目的就是通过HPLC（高相液相色谱）建立既快速又灵敏的方法来检测N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)这两种普遍存在的唾液酸。唾液酸在甲酸弱酸性质的水解下从寡糖链，糖蛋白和糖脂中释放出来。然后在1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯（DMB）的作用下，发生衍生反应，随后2分钟内可在Zorbax SB-Aq（安捷伦SB-Aq）快速解析柱中分离。这项方法在多种以牛奶为主的含0.3mg/100g到900mg/100g水平唾液酸的产品和食品中证实有效。同位素示踪实验显示唾液酸的回收率可以达到87%-108%。除一些特例外，其扩大的测量不确定度对Neu5Gc来说一般低于15%，而Neu5Ac或唾液酸的总量则一般低于10%。同时这种方法快速，准确，并且很容易在常规实验室建立依存性分析。研究背景 ：唾液酸的简介：唾液酸家族是一类基于神经氨酸结构的碳水化合物，最近将KDN及其衍生物也算作唾液酸家族的一员。到目前为止，已有50种唾液酸被鉴定出来。唾液酸可以在脊椎动物，一些无脊椎动物和一些微生物中被检测到，但好像并不存在于植物和原核生物中。已经有很多实验对唾液酸的生物学功能进行了解释。研究表明，唾液酸可能参与了分子间和细胞间的反应，细胞分化，增殖和癌的发生。它们也可能是细菌和病毒感染致病的重要因素。最近的研究甚至发现唾液酸在学习和记忆中扮演了重要的角色。唾液酸是牛奶的成分之一，作为牛奶中的寡糖成分，可在大脑的发育和保护机制的形成中扮演了重要的角色。奶制品中唾液酸的情况：Table1：人奶，牛奶和配方奶粉中唾液酸的水平我们已经研究了人奶，牛奶和婴儿配方奶粉中唾液酸的水平（table1）。在人初乳中，唾液酸可以达到2000mg/L，但大约十周后就会降至200-300mg/L。牛初乳（600mg/L）也比成熟牛奶（200mg/L）中唾液酸的水平高，但低于人乳中唾液酸的含量，一些研究证实成熟的牛奶中唾液酸的含量可能会低至10-65mg/L。在不同的牛奶中唾液酸水平的差异非常大。这主要是因为牛的种类，产地或供给的营养等造成的，也有可能是这些因素的综合。现在，对它们的系统研究还没有报道。另外，人奶中唾液酸的主要存在形式是糖蛋白，而牛奶中的主要形式是寡糖。对奶制品中唾液酸的分析：我们已经研究了人奶，牛奶和婴儿配方奶粉中唾液酸的水平（table1）。在人初乳中，唾液酸可以达到2000mg/L，但大约十周后就会降至200-300mg/L。牛初乳（600mg/L）也比成熟牛奶（200mg/L）中唾液酸的水平高，但低于人乳中唾液酸的含量，一些研究证实成熟的牛奶中唾液酸的含量可能会低至10-65mg/L。在不同的牛奶中唾液酸水平的差异非常大。这主要是因为牛的种类，产地或供给的营养等造成的，也有可能是这些因素的综合。现在，对它们的系统研究还没有报道。另外，人奶中唾液酸的主要存在形式是糖蛋白，而牛奶中的主要形式是寡糖。我们已经有很多分析唾液酸的方法，主要可以分为以下两种：分离法（色谱分析，电泳），不分离法（光谱技术）。一些光谱法的优点在于不需要将唾液酸从结合糖中释放出来，而是将其作为一个整体进行分析，其中使用到的主要试剂有-二甲氨基苯甲醛-HCL，苔黑酚，间苯二酚/Fe3+，Cu2+/HCL和高碘酸-3-甲基-2-苯并噻唑腙盐酸盐。其他流行的光谱技术，比如：硫代巴比妥酸分析，商业用途的酶联分析，都需要在分析前，将唾液酸从结合糖中分离出来。光谱法的优点在于它们能直接的进行应用，并且所用的仪器并不昂贵。可是有很多成分都会干扰对唾液酸的分析，这是限制它应用于一些复杂的物质的原因。唾液酸分析前的处理所有基于对唾液酸进行分离的方法，都需要在分析前将唾液酸从结合物中释放出来。我们有两种释放出游离唾液酸的方法：酶水解，酸水解。酶的水解通常需要在温和的条件下进行，这样唾液酸就能以稳定的形式存在，并且不会被修饰。而酶解法的缺点则是不能将其应用于不同类型的唾液酸，同时因为唾液酸结合的分子类型不同，不能使唾液酸100%的从结合物中释放。酸水解的环境较为强烈，唾液酸有可能会在分析前降解或修饰，但唾液酸的释放基本是100%的完成。因此，对唾液酸水解的研究就是在它的释放和降解或修饰中寻找平衡。于是就有很多不同的水解方法（table2）。在释放出游离的唾液酸后，有很多的方法可以进行分离，包括薄层色谱法，液相色谱法，气相色谱法，毛细管电泳法和质谱法，同时也可对这些技术联用进而进行更有效地分离。大部分唾液酸在分析前需要进行衍生反应。在使用液相色谱法时，我们首先要能在紫外线（UV）和荧光下对分子进行灵敏的检测。在气相色谱法中，被分析物应易于挥发。这些都需要对被分析物进行衍生化反应。高效阴离子交换色谱联用脉冲安培探测法（HPAEC-PAD）是少数的一种对唾液酸不需要进行衍生化即可进行灵敏分析的方法。很可能目前对唾液酸分析的最流行方法是Hara和他的同事在1987年时提出的，他们使用1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯（DMB）对唾液酸进行衍生作用，然后使用反向高效液相色谱进行分离分析。它的优点在于DMB衍生物对-酮酸的特异性和使用荧光进行检测上，这能让分析有很好的选择性和灵敏度。小结：唾液酸作为婴儿和儿童奶制品中的重要成分越来越受到重视。因此，很多公司都将其列为产品的配方之一。为了帮助产品的发展，并且能对唾液酸标识值进行有效的核实，就需要有合适的方法进行分析。为在最短时间内，使唾液酸的回收值最大，就需要对样品进行充分的水解和衍生。另外，进行反相分离的方法也被一种快速色谱柱所替代，这样，N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)在两分钟内即可被分离和洗提。研究内容及实验方案：实验的材料和方法：试剂： 所有使用的试剂都应达到分析纯或分析纯以上的标准。甲酸，硫酸，乙酸，甲醇（HPLC级纯）从Merck（Darmstadt, Germany）购买，硫酸氢钠，DMB，2-巯基乙醇，十二烷基硫酸钠从Fluka（Buchs, Switzerland）购买。两种经过认证的唾液酸Neu5Ac (98%) 和Neu5Gc (95%)购买于 Sigma（St. Louis, MO, USA）和U.S. Pharmacopeia（USP, Rockville,MD, USA）。水是从Milli-Q Plus water purification system（Millipore, Bedford,MA, USA）获得。神经氨酸酶（a-23,6,8,9）Arthrobacter ureafaciens（蛋白组级）购买于Sigma。唾液酸酶-A（在A. ureafaciens重组，在Escherichia coli中表达）从Prozyme（San Leandro, CA, USA）获得。DMB (7.0 mM)保存于含2-巯基乙醇(0.75 M)和十二烷基硫酸钠(18 mM)的醋酸(1.4 M) 中。Table2：唾液酸分析前处理的方法步骤： 称取大约100-500g唾液酸的样本，放入200ml的烧瓶中。随后加入100ml的热水（60C），并在室温下搅拌悬浮液10分钟，冷却至室温后，加水至刻度处。在微管中用200l的样品溶液与相同体积的甲酸（1M）混合，在80C下水解2h。溶解后的样品溶液放置冰上冷却，再转移至离心管（Ultrafree MC Biomax-30, Millipore），在5000g下离心10min。在棕色的微管中，将200l的离心后的水解产物和相同体积的DMB溶液混合，在80C下加热50min。衍生后的样品随后在冰上冷却，再加入400l水使之稀释。色谱：DMB衍生物的分析是由Class-VP软件的控制的Shimadzu Prominence HPLC系统和Shimadzu RF-10Axl荧光探测器（Shimadzu,Kyoto, Japan）的联用装置完成的。荧光在4增益，中等灵敏度，1.5s回应时间，5Hz进样率的条件下由发射器控制，分别在448nm和337nm波长下进行激发。唾液酸的分离是在30C下由Agilent Technologies（Santa Clara, CA, USA）提供的Zorbax SB-Aq（安捷伦SB-Aq）快速解析柱（3.5 m, 4.650 mm）中完成的。与水/乙醇/乙酸(75:25:0.05, v/v/v)混合液稀释的唾液酸DMB衍生物以2.0ml/min的速度进行流动。2.5min后，柱子用水/乙醇/乙酸（80:20:0.05, v/v/v）洗脱1.2分钟，再在开始的条件下重新平衡3.3min（共7min）。每天结束后，柱子要在含水乙醇（1:1，v/v）以1.0ml/min的流动速度下进行1h的清洗。通常，在更换前可以使用2000次，每次可以加10l体积的样。自动采样器要在4C下保存。衍生后的Neu5Gc 和Neu5Ac分别在保留时间为1.3min和1.6min下进行洗提。Neu5Gc 和 Neu5Ac一系列标准浓度溶液与样品的处理方式相同（除在水解时未加热外），在这种条件下，再进行校正。峰值区域通常可用来进行量化。可靠性检测： 我们选择七种产品作为母体对这种方法进行可靠性的检测。所有的样品都以牛奶为基础，包括浓缩乳清蛋白，奶粉，成长奶粉，粉状冲剂饮料，液体冲剂饮料，儿童麦片和酸奶。另外，以大豆为主的婴儿配方产品在同位素示踪实验中用作空白对照。为对唾液酸的线性范围进行更全面的研究，我们对五种不同浓度范围的样品进行分析。对每种浓度范围，分别对8个均等间隔的浓度进行进样，每份样进三份。在色谱柱中，对Neu5Ac浓度的研究分别在0.02 -0.16 ng, 0.13- 0.29 ng, 0.22-1.01 ng, 0.61 - 4.89 ng, 和4.48-5.63 ng之间，对Neu5Gc的浓度研究则在0.004-0.031 ng, 0.02-0.18 ng, 0.11 -0.89 ng, 0.57-4.56 ng, 和 4.18-5.24 ng之间。线性的程度是由校准曲线图，响应因素和残样量共同决定的。检测下限（LoD）是由每种被分析物在保留时间中测量到的基线噪声和三倍基线噪声高度时的被分析物浓度共同决定的。Neu5Ac在色谱柱中的检测下限为15.6pg。Neu5Gc在色谱柱中的检测下限为5.4pg。为了对重复性和再现性进行测定，每个样本由三位不同的分析师在至少不连续的8天内对同一样本在同一实验室里通过6种不同的DMB试剂进行处理，4种不同批次的标准唾液酸溶液和3种不同的分析色谱柱进行分析。我们对该方法的准确性检测是将每个被分析物的母体进行8种不同示踪同位素的标记，分别再对它们三种不同水平的浓度进行检测（示踪同位素的水平需要适应每种样本的母体且各值要处于线性范围内）。每种样本母体在重复的条件下对其各示踪同位素水平进行6次分析。所有数据的分析是在充分有力的统计数据和内部统计程序Q-stat下进行的。实验方案的选择：色谱条件：DMB标记的唾液酸一般是在混合物乙腈，乙醇和水做流动相的条件下在反相色谱柱中进行分离的。有时，酸或缓冲液对唾液酸的修饰会对唾液酸的分离进行调节。Table2中可以找到对几种流动相的总结。目前对分离条件的研究是基于Hara和他的同事的成果，即使用DMB对唾液酸（Neu5Gc和Neu5Ac）进行衍生。Hara和他的同事共列出十一种利用乙腈/乙醇/水（9:7:84, v/v/v）做流动相的色谱柱（table3）。包括4种长度为150mm的色谱柱（颗粒大小3 - 5 m，柱径2.1 - 4.6 mm），6种用于快速HPLC的色谱柱（4.650 mm)，颗粒大小为1.8 -3.5 m和一种颗粒大小为3.5-m的与苯基结合的固定相的色谱柱（4.650 mm)。在长的色谱柱中，Zorbax SB-C18与其他色谱柱相比分离效果最好，且峰形最好（拖尾因子：Neu5Gc：1.08，Neu5Ac ：1.04）。Sunfire C18与它相似，但拖尾因子较高。在短的色谱柱中，Zorbax SB-C18和 Sunfire C18效果也是最好的。Sunfire C18对唾液酸的分析和高分辨率的测定能与理论值有很好的符合性。尽管Neu5Gc在 Zorbax SB-C18色谱柱中的拖尾因子稍低，但被分析物这两种色谱柱中的拖尾因子基本相似。综上，最优化的方案为选择Zorbax SB-C18做色谱柱。Table3：对Neu5Gc和Neu5Ac的不同HPLC色谱柱的比较我们对几种混合溶液在不同比例的乙腈，乙醇和水（也可用含水的缓冲液或稀酸代替）的混合物做流动相的条件下在Zorbax SB-C18中进行了检测。在使色谱柱适应流动相的前提下，虽然可以将两峰间的分辨率由1.61提高到2.87，但却同时会影响到峰的对称性。不过，随着流动相不断地优化，最近出现了一种新的，快速的色谱柱Zorbax SB-Aq。因为它有优良的对称性，且要比Sb类型的色谱柱有更优良的性质。同时，在所有的流动相下，SB-Aq均比SB有更好的峰形，尽管分辨率有所下降。因此最终选择以乙腈/乙醇/乙酸（25:75:0.05, v/v/v）为流动相，以Zorbax SB-Aq(4.6 * 50 mm, 3.5 m)为色谱柱的色谱系统。它的选择是基于层析效能，配制流动相的难易度和与液相色谱-质谱联用的综合考虑下做出的。标准物和样本的色谱峰图见Fig.1.水解条件的最优化： 我们可以用酶或酸对唾液酸的复合物进行水解，从而使其从结合糖中释放。尽管酸水解便宜有效，但却很难在被分析物的释放和水解过程中达到很好的平衡。比如，有报道称在50 mM 硫酸或 100 mM 盐酸(50 min, 80 C)的水解下，唾液酸会有10%的损失。相似的，在25 mM盐酸, 25 mM 三氟乙酸(TFA), 或2 M乙酸 (2 h,80 C)的水解下，会造成唾液酸20%的损失。根据Lamari，Karamanos 和Schauer的研究，甲酸造成的损失最小，但可能不能彻底完成水解。为了让唾液Fig.1：Neu5Gc和Neu5Ac在不同样品中的色谱图。G：Neu5Gc，A:Neu5Ac酸更有效地被释放和最大限度的减小损失，因此就有很多唾液酸在不同水解条件下的报道（table2）。虽然酶水解在充分的反应后也不大可能降解唾液酸，但是因为在酶的水解后仍有很多未被水解的残余物，因此很难达到唾液酸的定量测定。所以，就有很多酸水解和酶水解的水解条件方案，对唾液酸的结合物进行水解。成长奶粉（Nestl Excella Gold）作为一种模式样本母体，它的酸水解有乙酸水解（Hara和他的同事），硫酸氢钠水解（Anumula）和甲酸(0.5 M)三种水解方式，最终得到Neu5Ac和 Neu5Gc两种水解产物。这两种水解方式都是在80C的条件下进行的（Fig.2）。同时，样本也可以在37C，由两家不同公司提供的唾液酸酶（EC 3.2.1.18）的作用下进行水解（Fig.2）。其中的一项最重要发现也许就是Neu5Ac和 Neu5Gc所需的水解条件不同。比如说当使用硫酸氢钠进行水解时，Neu5Gc在30min后达到水解的最大值，而Neu5Ac在1.5h后才可以达到水解的最大值。另一方面，在甲酸或乙酸的水解条件下，Neu5Ac到达水解的最大值（分别2h和3h）要比Neu5Gc快，Neu5Gc在4h后仍达不到水解的最大值。Fig.2:不同水解条件下婴儿配方奶粉的检测尽管乙酸（2M）经常在文献中被提到用于水解反应（table2），但我们在研究中发现0.5M甲酸进行水解，样品有更高的回收率（Fig.2）。唾液酸酶水解释放的Neu5Ac与乙酸作用释放的量相似，不过，酶的价格较贵，并且难以掌握。同时，若用唾液酸酶，Neu5Gc的吸收峰会扭曲且不易被整合。目前干涉的来源和对它的判定还未搞清和解决，很可能是由于未知曲线造成的影响。Fig.2是酶的水解线，希望能对其做出适当的说明。 唾液乳糖也可由乙酸，甲酸和唾液酸酶进行水解。这样，通过唾液乳糖的水解量就可以很好的计算唾液酸的理论当量，因而可以对唾液酸的回收进行有效地估计。当用甲酸（0.5M，80C）水解成长奶粉，1h后唾液酸的水解就达到了最大回收率，为88.2%，2h后则能达到释放的最大值。用甲酸水解2h后，回收率会稍有下降，为86.8%。当用乙酸进行水解（1.8 M, 3 h, 80 C），其回收率为85.5%。当使用唾液酸酶，1h后回收率就能达到88.0%，并且在4h内回收率都能维持稳定（更长的时间未进行研究）。当使用0.5M的甲酸去水解唾液乳糖，Neu5Ac的回收率可以和用乙酸和唾液酸酶进行水解相比。当水解成长奶粉时，与其他酸水解相比，使Neu5Gc和Neu5Ac的释放的最有效地方式是使用甲酸（0.5 M, 2 h, 80 C）水解，而同时其释放的唾液酸的量与酶水解释放的量相当。使用50mM硫酸（1 h, 80 C）进行水解是另一种常用的水解唾液酸复合物的方法。这种水解方法在应用于成长奶粉样品和胎球蛋白时可以和用甲酸（2h，80C）水解相比。Table4比较了两者的值。不过，在研究两种DMB标准唾液酸衍生物溶液的RF值时，使用硫酸的值要比使用甲酸的值低15%-20%，同时当使用硫酸时，会发现在Neu5Ac的附近有伴随峰。Table4：唾液酸水解的比较我们在甲酸（0.5 M, 2 h, 80 C）和硫酸（50 mM,1 h, 80 C）的水解条件下分别对游离唾液酸的降解进行了研究。同没有加热的溶液相比，在峰值区域两者分别损失6%，4%。这里的唾液酸降解的量要比以前报道过方法的降解的量略低。不过，这些数字并不意味着处于结合糖状态（大部分样本中唾液酸的存在形式）的唾液酸就很稳定。因此，为了避免校正过度，这里我们不用在矫正曲线上补偿水解中的降解部分（假设结合状态的唾液酸比游离状态的唾液酸稳定）。尽管用硫酸进行水解的结果和这些用甲酸进行水解的结果相似，同时还能减少水解的时间，但是用硫酸进行水解后在色谱图上会有一些微弱的干涉信号。因此最终为避免这些多余的信号，决定使用甲酸对样品进行水解。衍生条件的最优化：一般，为了能简单直接的对不含生色团的碳水化合物进行检测，一般使用UV之类的液相色谱法。对碳水化合物较为有效和灵敏的分析方法是对其进行荧光标记。对唾液酸的检测，有以下几种衍生手段，包括过-O-苯酰化酌，用1,2-二胺-4,5-二甲氧基苯（DDB），4-肼基-2-芪唑盐酸盐，邻苯二胺（OPD）或DMB进行标记。衍生化的最普遍方法就是使用DMB（一种与-酮酸发生特异反应的化合物），这样能使唾液酸衍生出酞嗪酮。OPD也被认为是有效的衍生试剂，同时据现有的报道，使用它发生衍生反应所花费的时间比使用DMB短。虽然使用OPD进行水解的时间短，但是HPLC的对DMB的衍生物分离更优化，而用OPD进行衍生反应的唾液酸则不适合进行HPLC的分离。因此，虽然OPD在衍生反应方面有很多优点，并且可以在40min内完成反应，这种试剂却并没有继续研究下去。因此，我们选择DMB作为衍生试剂，同时对衍生反应的时间，温度，和与酸的耦合反应等方面进行优化。文献中（Table2），大部分DMB衍生的条件都相似，除了一些溶剂的浓度略有不同外，衍生反应都是在50C到60C的条件下进行的，通常反应的时间是2.5h左右。注：除了中村和他的同事在100C，很短的时间内进行唾液酸的衍生反应。不过，在他们发表的论文中，唾液酸并不是作为被分析物研究的（不是为了检测唾液酸的量），他们的目的是揭示各种衍生试剂的不同。在对唾液酸进行的衍生反应中，Hara和他的同事通过唾液酸的一系列标准溶液和特定的反应条件研究了荧光反应强度的相对反应时间。他们发现在反应5h后，峰值依然在增加。Stanton和他的同事及Manzi和他的同事发现，如果将被标记的唾液酸置于4CHPLC自动取样器的环境中储存，在分析时再进行注射，也会有相似的现象。Hara和他的同事发现若反应在很高的温度下进行，反应的速度会变快。Fig.3中我们可以看到80C下的反应状况，其中平行线（2.5 h, 50 C）是Hara和他的同事做的空白对照。对于Neu5Ac，反应在80C，40-50min左右就能达到反应的最大值。不过，Neu5Gc有点不同，在研究时间内它并没有达到反应的最大值。因为Neu5Ac是牛奶（婴儿配方奶粉，成长奶粉）最丰富的唾液酸，所以通常对衍生反应的优化主要针对Neu5Ac。即使Hara和他的同事发现Neu5Ac在80C下无法达到检测器的最大反应，但因为在这个温度下，衍生反应完成的最快，所以常使用这种条件。不过若要避免检出限的问题，则要在更低的温度下进行较长时间的反应。我们选择在80C，50min用DMB做衍生反应试剂进行衍生反应（Hara和他的同事的方法）。我们使用的DMB是1年内在-20C下储存于棕色离心管的200lDMB（Reuter和Schauer的研究）。、Fig.3：唾液酸的衍生反应 唾液酸的DMB衍生物的稳定性也在研究中。标准的Neu5Ac和Neu5Gc混合液照上述的方法进行衍生反应，在24h后注射141份它们的溶剂发现，尽管峰值不断地增加，但是最小值和最大值的相对标准偏差为0.5%时，它们之间相差2%。因此发生DMB衍生反应的唾液酸在4C时相对来说较为稳定。同时一份试剂注射后，其运动的时间为7min，因此我们可以在几小时内完成一系列被分析物的分析，而不用担心DMB衍生物发生变化。方法的正确性检测： 对色谱柱中Neu5Ac检测的线性范围是0.12-4.8ng，对Neu5Gc检测的线性范围是0.02-4.5ng。两者的校准曲线可以见Fig.4Fig.4：一般方法校正曲线的线性范围 方法的准确性是由实验的重复性和中间重现性体现的（Fig.5）对Neu5Ac，除酸奶的重复性的相对标准偏差（RSD(r)）为7.22%外，其余RSD(r)小于2%，除粉末冲剂饮料的中间再现性的相对标准偏差RSD(iR)为3.58%和酸奶的RSD(iR)为6.79%外，其余RSD(iR)均小于3%。对Neu5Gc，除酸奶的RSD(r)为7.94%外，其余的RSD(r)在3.2%以下，除酸奶的RSD(iR)为6.45%和液体冲剂饮料的RSD(iR)为9.31%外，其余的RSD(iR)均在5.5%以下。唾液酸是由Neu5Ac和Neu5Gc的总量和表示。数据的统计分析发现Neu5Ac是所有的产品中唾液酸的主要成分（通常95%以上）。和其他的研究者的数据相比，我们的数据有很好的准确性：Hara和他的同事得到Neu5Ac标准物的RSD(r)值在3%-5%之间，Neu5Gc标准物的RSD(r)值在2%-5%，Stanton和他的同事分析从糖蛋白游离出的Neu5Ac的RSD(r)为5.1%。Martin和他的同事通过分析奶制品（婴儿配方奶粉）得到的唾液酸的正确性检测的数据显示，Neu5Ac的RSD(r)的值为2.7%-4.8%，RSD(iR)为4.4%（未检测Neu5Gc）。很难有恰当的方法获得实验的准确性数据（回复值）。理论上，使用能与唾液酸结合的很好的材料做基准物质。可是，这样一种基准物质并不存在。USP提供了两种结合唾液酸的物质：Neu5Ac和Neu5Gc。我们已知其中游离唾液酸的含量并分别对这些物质在水解和未水解的状态下进行分析。未水解的情况下，我们能得到极好的回收率，其中Neu5Ac是95%，Neu5Gc是100%。充分有力的数据表明没有一个值与100%有显著地差异。相反，水解后，Neu5Ac的回收率下降到90%，Neu5Gc的回收率下降到94%。这些数据表明水解后的唾液酸回收率与100%有显著性差异。通过同位素示踪法对从食物中回收到的唾液酸进行检测，我们共检测了三种水解后游离唾液酸的浓度水平（Table6-8）。通过USP提供的理论数据，我们发现回收率大体与100%有显著性的差异，Neu5Ac回收率的范围是87%-102%，Neu5Gc是90%-108%，两者总和的范围是87%-102%。和Martin和他的同事的回收率数据进行比较，Martin得到的婴儿配方奶粉（与成长奶粉相似）中Neu5Ac的回收率范围为98%-103%，与目前的方法得到的范围96%-101%相似。在以大豆为主要成分的饮品中，回收率也很相似，Martin和他的同事的得到的回收率为97%-99%，目前的方法得到的回收率为95%-98%。在乳清蛋白浓缩物的样本（WPC）中，同位素示踪法显示其回收率很低。这可能主要是由于回收实验中的设计原因。WPC中的唾液酸的浓度很高（9210mg/kg）。因此，为了在检测器的检测范围内保留WPC处理后的样本和保持唾液酸的最终浓度水平，示踪同位素法的水平与天然唾液酸的浓度相比需要足够的低（天然唾液酸的20%，40%和60%被同位素标记）。而对另一种样品来说，当天然物的浓度越低，而示踪同位素法的标记程度越高，回收率就越好。Table7：Neu5Gc的回收率Table6：Neu5Ac的回收率 Table9：测量的不确定度Table8：唾液酸的回收率测量的不确定度是由Barwick和Ellision通过将中间重现性和回收实验结合而得到的数据（Table9）。对于Neu5Gc的检测，除了液体冲剂饮料中的不确定度为18.9%，其余样品中Neu5Gc的检测的不确定度在15%以下。大部分样品中Neu5Ac的检测的不确定度在10%以下（除WPC和酸奶外）。对结合状态的唾液酸来说，其不确定度会有所扩大。而对WPC来说，回收率是其不确定度扩大的主要因素，正像前面提到的，很可能这是由于回收试验的设计所造成的。而对于酸奶来说回收率和中间重现性是不确定度扩大的重要原因。尽管酸奶进行实验后得到的结果较为合理（如：基于HorRat的结果，唾液酸的中间重现性为0.97），但是在这项研究中，与从其他样品获得的数据相比，还是很不理想。这说明对酸奶来说，我们对它的处理还有提升的空间。实验结果：在牛奶和配方奶粉方面的应用： 我们用优化的方法对牛奶和婴儿配方奶粉的样本进行了优化。尽管不能直接应用于液体牛奶，但是该方法已确认对奶粉和含奶饮料（溶解）有效，因此对牛奶样本的分析来说不会引进新的问题。同样的，因为婴儿配方奶粉和成长牛奶之间非常相似，对成长牛奶的分析来说不会有新的问题。我们从当地杂货店买的经巴氏消毒法消毒的牛奶，山羊奶和绵羊奶，并从中获得相应的样本。通过已知方法（Table10）对每种样本进行重复的分析。发现Neu5Gc的含量在牛奶中的含量最低（5mg/kg），在绵羊奶中的含量最高（214mg/kg）。相反，Neu5Ac在牛奶中的含量最高（185mg/kg），在山羊奶中的含量最低（20.2mg/kg）。牛奶中唾液酸的检测值（假设只有Neu5Gc和Neu5Ac）与Neeser和他的同事及Morrissey先前得到的值相似。不过，这个结果要比Tang和他的同事, Puente 和他的同事及Kargin Kiral和他的同事得到的结果高得多。Puente 和他的同事从山羊奶中得到唾液酸含量（180-240mg/kg）要稍高于我们研究的结果（170mg/kg），不过两组数据之间还是具有可比性的。相似的，Morrisey得到的哺乳期后期的山羊奶中唾液酸的浓度水平（175mg/L）与我们得到的数据相似。目前我们所了解的是，哺育，营养的摄取和气候的不同会影响牛奶中唾液酸的组成。不过，牛奶中唾液酸的含量由于不同的方法而造成结果的不同也需要进行考虑。对奶制品制造商而言，唾液酸含量的多少已经成为需要考虑的重要因素。大量的婴儿配方奶粉和成长奶粉从Nestl Nutrition (Vevey, Switzerland)中获得，当然也包括其他竞争者的产品。含唾液酸的产品通过我们的方法进行测量后，唾液酸的总量是由Neu5Ac和Neu5Gc量的和得出，各唾液酸的量见Table10。Neu5Ac的量一般为唾液酸总量的96%，与牛奶中唾液酸的含量相似。不同产品中唾液酸的含量范围是96mg/kg-261mg/100g，与Table1中的数据相符。产品A的唾液酸含量最高，是我们唯一对初乳配方进行分析的数据。我们可以看到，初乳中的唾液酸的浓度水平很高。唾液酸将会成为一种广受关注的营养物质。对制造商们而言，他们需要对他们含唾液酸的产品中的唾液酸进行可靠，有效地分析。他们也需要一种受到认同的方法去帮助他们对自己的产品进行改进，对自己产品中的唾液酸进行量的控制。同样，一般实验室也需要相似的方法去确认他们所分析产品的标识。这种方法将会满足奶制品工业的需要。Table10：牛奶和配方牛奶中唾液酸的分析结论： 我们改进了Hara和他的同事的方法，并证实该方法在奶制品中对Neu5Ac和Neu5Gc的检测有效。同时我们对色谱条件也进行了相应的改进，两种唾液酸在快速解析HPLC色谱柱中2min内即可分离，分离的总时间为7min（包括重新对色谱柱进行洗脱和平衡）。当使用USP提供的标准物时，没有进行水解的唾液酸的回收率置信区间为95%，比进行水解的回收率低5-6%。在奶制品中，回收率的范围在87%-108%之间，其扩大的相对不确定度在4.2-19%之间。评述：综述： 为了让大家更好的了解这篇论文，我再对这篇论文进行一个小结。首先这篇论文作者的目的是使用一种灵敏的方法对奶制品中的唾液酸（Neu5Gc和Neu5Ac）进行即快速，又灵敏的检测。他在前人的基础上(主要是Hara和他的同事)，对HPLC分离Neu5Gc和Neu5Ac进行了改进。作者通过对十二种不同类型的色谱柱的综合比较，以色谱柱的层析效能和流动相的流动速度为评判标准，最终决定使用Zorbax SB-Aq(4.650 mm, 3.5 m)为该方法的色谱柱。同时作者通过酸水解和酶水解的对比，在两者水解唾液酸结合物的时间长短，水解后唾液酸的状态及唾液酸水解释放的比例等综合因素，选择用酸水解来进行。随后作者又将酸水解中的乙酸水解，硫酸水解，甲酸水解的方法进行比较，最终选择水解速度快，唾液酸回收率高的甲酸水解法。接着作者又对目前常见的两种唾液酸的衍生方式（OPD衍生反应和DMB衍生反应）进行对比，最终在衍生反应的时间，与HPLC的搭配及衍生物的稳定等方面选择了DMB在80C，50min对唾液酸进行衍生。最后，为了对自己的方法的可靠性进行判断，作者对自己实验的重复性和中间重现性的结果与以往的数据进行了比较，又通过RSD(r)及RSD(iR)，回收率和不确定度的，证明了数据的可靠性。作者在这一系列的对比和论证后亲自用自己的方法对一些奶制品进行了分析，通过对以往数据的对比和各种因素的讨论，证明了自己方法是有效而又灵敏的，也对自己的方法应用于奶制品工业充满了信心。该研究的优点：首先，我们可以看到作者在这项研究中的严谨，作者通过不断地举例对比，将以往使用HPLC方法分离分析唾液酸的方法的每一步，几乎都进行了优化，可见该研究的深入及彻底。色谱柱的选择：这项研究的其中一个优点就是选择了合适的色谱柱，不仅柱效良好，而且色谱分析的时间得到了很好的优化。通过新型色谱柱的应用，流动相在其中的流动速度能达到2ml/min，唾液酸在HPLC中的分离时间缩短至7min。而之前Hara及他的同事所用的色谱柱TSK gel ODS-120T分离时流动相的速度只能达到0.9ml/min。同时作者在选择色谱柱对流动相的搭配和对被分析物的性质上，也恰到好处，ZORBAX SB系列的色谱柱有以下特性：“安捷伦ZORBAX StableBond柱采用专利的，独特的单官能团硅烷，带有较大的二异丁基(SB-C18)或二异丙基(SB-C8，SB-C3，SB-Phenyl，SB-CN和SB-Aq)空间位阻侧链基团，保护关键的硅氧键在低pH条件下免受水解的进攻。为保证在酸性流动相条件下的稳定性，长寿命及重现性，StableBond填料不封端。由于高纯度，低酸性的硅胶对酸性、碱性以及中性化合物具有优异的峰形，从而使得StableBond柱成为在低pH开发方法时的首选色谱柱。ZORBAX StableBond柱与所有常用的流动相兼容，包括水含量很高的流动相。”。作者在这里使用的几种流动相分别是：水/乙醇/乙酸(75:25:0.05, v/v/v), 水/乙醇/乙酸（80:20:0.05, v/v/v）, 含水乙醇（1:1，v/v），都可以很好的与ZORBAX SB-Aq兼容。唾液酸作为9-碳单糖的衍生物，可以使用反相色谱（流动相极性大于固定相极性）的方法对其进行分离，同时唾液酸又是偏酸性的，因此Zorbax SB系列（包括SB-Aq）的色谱柱均可以很好的满足对它的分离分析。作者随后对这一类型的色谱柱对分离唾液酸的柱效进行对比，最终选择了Zorbax SB-Aq作为色谱柱。正确的选择色谱柱对他的研究目标（快速灵敏的对唾液酸进行分析）的达成起了不小的作用。用甲酸对唾液酸结合物进行水解： 我认为该研究中最大的优点就是使用甲酸进行唾液酸结合物的水解。从最近一篇综述中可以看到，酸水解中的几种主要方法是：25mM HCl,25mM三氟乙酸(TFA), 25mM硫酸和2M乙酸。但是这几种物质会造成很大的损失，有的甚至会造成20%的损失，并且水解花费的时间较长，远不如酶水解的方式有效。 虽然也有文献介绍过甲酸作为一种酸水解的方式很有效,但是一般认为甲酸水解，唾液酸达不到很好的释放量。而作者根据这几种酸对唾液酸水解的回收率，水解时间及水解时唾液酸降解的量，发现对成长奶粉（Nestl Excella Gold）这种模式样本来说，甲酸只需1h的水解就可达到比起他酸水解更好的最大回复率，同时甲酸对唾液酸造成的损失又比其他方法酸水解造成的损失小，从这几个方面看，甲酸对唾液酸的水解效果与其他酸水解唾液酸相比，优势很大，比起水解效果很好的唾液酸酶，也丝毫不逊色。同时，研究还发现，经过甲酸水解，2h后，回收率只是略有下降，且唾液酸释放程度并不低于其他酸水解时唾液酸的释放程度。因此与比起酶水解，甲酸水解有较大的优势。同时，酸水解中的硫酸水解法虽然效率也很高，但是与甲酸水解相比，其RF值较低且有伴随峰。因此最终选择了甲酸水解的方式。我们可以从Fig.2上看到甲酸水解的优势。从对牛奶中唾液酸分析的结果上看，其对牛奶中唾液酸的检测的最终结果比起Tang, Puente 和及Kargin Kiral等人的结果要高，很可能是因为甲酸水解方式快速，损失小，水解过程中较稳定等的原因。从这一方面说，作者得到的结果可信度更高。对于将其应用于实践和快速灵敏的对奶制品进行检测来说，因为甲酸水解的应用，要比其他方法更有可行性。DMB衍生反应的条件： 这应该不算这项研究的优点，因为80C下的衍生反应，可能会提高荧光检测器的检测限，因此对Neu5Gc（含量在通常5%以下）的检测可能会造成不灵敏的现象。但是这么做能满足作者的目标-快速。该条件下，只需50min就可完成唾液酸的衍生反应，而Hara等人在50C下需要2.5h才能达到相似的结果，因此说在应用的方面，提高温度有其实际的意义。缺点：因为这项研究主要针对奶制品，因此虽然已知牛奶中唾液酸的主要存在形式为结合糖，但对于配方奶粉，羊奶等，却并未考虑到人工添加其他形式的唾液