紫外可见分光光度法终.ppt

第十四章紫外 可见分光光度法 Ultravioletandvisiblespectrophotometry UV VIS 中国的 墨经 记录了世界上最早的光学知识 它有八条关于光学的记载 叙述影的定义和生成 光的直线传播性和针孔成像 并且以严谨的文字讨论了在平面镜 凹球面镜和凸球面镜中物和像的关系 墨子在当时就已知道光是沿直线传播的 墨子和他的学生做了世界上最早的 小孔成像 实验 并对实验结果作出了精辟的见解 在一间黑暗的小屋朝阳的墙上开一个小孔 人对着小孔站在屋外 屋里相对的墙上就会出现一个倒立的人影 墨经 中对此解释道 景光之人煦若射 下者之入也高 高者之入也下 意思是 因为光线如箭般直线行进 人体下部挡住直射过来的光线 射过小孔 成影在上边 人体上部挡住直射过来的光线 穿过小孔 成影在下边 就成了倒立的影 这是对光沿直线传播的第一次科学解释 牛顿光学实验 其实还有肉眼看不到的紫外光 德国科学家里特 1801年在研究光谱的不同部分对氯化银的作用时发现 随着向紫光方向移动 化学活性增加 在紫外部分 仍存在着一种不可见射线 使氯化银变黑 从而发现了紫外线 1为什么上述溶液呈现不同的颜色 两个问题 2将温度计置不同光区 有何现象 而后将KMnO4溶液置于温度计和光区之间 又有何现象 由于溶液对光的选择性吸收引起的 溶液呈现的是被吸收物质的互补色 单色光 复色光 互补光 原因 如何更精确地 或通过什么仪器 说明物质具有选择性吸收不同波长的光的性质 问题 续 1 c KMnO4 1 56 10 4mol L 12 c KMnO4 3 12 10 4mol L 13 c KMnO4 4 68 10 4mol L 1KMnO4溶液的光吸收曲线 吸收曲线测定方法 最大吸收峰 第一节光学分析概论 一 电磁辐射和电磁波谱二 光学分析法及其分类三 光谱法仪器 分光光度计 赫兹 德国物理学家 赫兹对人类伟大的贡献是用实验证实了电磁波的存在 发现了光电效应 1888年 成了近代科学史上的一座里程碑 开创了无线电电子技术的新纪元 赫兹对人类文明作出了很大贡献 正当人们对他寄以更大期望时 他却于1894年因血中毒逝世 年仅36岁 为了纪念他的功绩 人们用他的名字来命名各种波动频率的单位 简称 赫 一 电磁辐射和电磁波谱 1 电磁辐射 电磁波 光 以巨大速度通过空间 不需要任何物质作为传播媒介的一种能量 2 电磁辐射的性质 具有波 粒二向性波动性 粒子性 实验测得真空中光速 续前 3 电磁波谱 电磁辐射按波长顺序排列 称 射线 X射线 紫外光 可见光 红外光 微波 无线电波 电磁波谱 二 光学分析法及其分类 一 光学分析法依据物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用而建立起来的各种分析法的统称 二 分类 1 光谱法 利用物质与电磁辐射作用时 物质内部发生量子化能级跃迁而产生的吸收 发射或散射辐射等电磁辐射的强度随波长变化的定性 定量分析方法 续前 2 非光谱法 利用物质与电磁辐射的相互作用测定电磁辐射的反射 折射 干涉 衍射和偏振等基本性质变化的分析方法分类 折射法 旋光法 比浊法 射线衍射法 3 光谱法与非光谱法的区别 续前 三 发射光谱 四 吸收光谱 例 射线 x 射线 荧光 例 原子吸收光谱 分子吸收光谱 三 光谱法仪器 分光光度计 主要特点 五个单元组成 光源 单色器 样品池 检测器 记录装置 单波长单光束分光光度计 目视比色法 特点 利用自然光 比较吸收光的互补色光 准确度低 半定量 不可分辨多组分 方法简便 灵敏度高 早期的显示方法 基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法 分为 光谱分析法和非光谱分析法 光谱分析法是指在光 或其它能量 的作用下 通过测量物质产生的发射光 吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法 吸收光谱分析发射光谱分析分子光谱分析原子光谱分析 在光谱分析中 依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法 主要有 红外吸收光谱 分子振动光谱 吸收光波长范围2 5 1000 m 主要用于有机化合物结构鉴定 紫外吸收光谱 电子跃迁光谱 吸收光波长范围200 400nm 近紫外区 可用于结构鉴定和定量分析 可见吸收光谱 电子跃迁光谱 吸收光波长范围400 750nm 主要用于有色物质的定量分析 本章主要讲授紫外可见吸光光度法 第二节紫外 可见吸收光谱 一 紫外 可见吸收光谱的产生二 紫外 可见吸收光谱的电子跃迁类型三 相关的基本概念四 吸收带类型和影响因素五 Lamber Beer定律六 偏离Beer定律的因素 一 紫外 可见吸收光谱的产生 1 分子吸收光谱的产生 由能级间的跃迁引起 能级 电子能级 振动能级 转动能级跃迁 电子受激发 从低能级转移到高能级的过程 续前 2 分子吸收光谱的分类 分子内运动涉及三种跃迁能级 所需能量大小顺序 3 紫外 可见吸收光谱的产生由于分子吸收紫外 可见光区的电磁辐射 分子中价电子 或外层电子 的能级跃迁而产生 吸收能量 两个跃迁能级之差 若用一连续的电磁辐射照射样品分子 将照射前后的光强度变化转变为电信号并记录下来 就可得到光强度变化对波长的关系曲线 即为分子吸收光谱 对于我们经常使用的紫外吸收光谱图 如果改变通过某一物质的入射光波长 并记录该物质在每一波长处的吸光度A 然后以波长为横坐标 以吸光度为纵坐标 这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线 紫外可见吸收光谱示意图 美洛昔康UV 分子轨道理论 当两个原子结合 组成共价键时 原子中参与成键的电子组成新的分子轨道 两个成键原子的原子轨道组成一个能量较低的成键轨道和一个能量较高的反键轨道 同时由于电子对组成共价键可以分为 键和 键 二 紫外 可见吸收光谱的电子跃迁类型 紫外可见吸收光谱是由分子中价电子能级跃迁产生的 这种吸收光谱取决于价电子的性质1 电子类型形成单键的 电子C H C C形成双键的 电子C C C O未成对的孤对电子n电子C O 例 轨道 电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同 电子所具有能量不同 基态与激发态 电子吸收能量 由基态 激发态c成键轨道与反键轨道 n 能量 n 跃迁 n n 图示 b 跃迁所需能量为 n n 分子中电子的能级和跃迁 电子跃迁类型 1 跃迁成键 电子跃迁到反键 轨道所产生的跃迁 跃迁所需能量很大 相当于远紫外的辐射能 200nm 饱和烃只能发生 跃迁例 CH4 max 125nmC2H6 max 135nm常用饱和烃类化合物作紫外可见吸收光谱分析的溶剂 只能被真空紫外分光光度计检测到 2 n 跃迁未共用电子对n电子跃迁到反键 轨道所产生的跃迁 这类跃迁所需能量比 跃迁小 200nm左右 150 250nm 吸收概率较小 在102 103范围内 中吸收 含有未共用电子对的杂原子 N O S X 的饱和化合物发生n 跃迁 含 NH2 OH X例 CH3OH max 184nmCH3Br max 204nm 3 跃迁 电子跃迁到反键 轨道所产生的跃迁 这类跃迁所需能量比 跃迁小 若无共轭 与n 跃迁差不多 200nm左右吸收强度大 在104 105范围内 强吸收若有共轭体系 波长向长波方向移动 相当于200 700nm含不饱和键的化合物发生 跃迁C O C C C C 4 n 跃迁 n电子跃迁到反键 轨道所产生的跃迁 这类跃迁所需能量较小 吸收峰在200 400nm左右吸收强度小 102 弱吸收含杂原子的双键不饱和有机化合物C SO N N N 例 丙酮 max 280nmn 跃迁比 跃迁所需能量小 吸收波长 图示 续前 注 紫外光谱电子跃迁类型 n 跃迁 跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构 推测可能产生的电子跃迁类型 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型 推测分子中可能存在的基团 分子结构鉴定 三 相关的基本概念 1 吸收光谱 吸收曲线 不同波长光对样品作用不同 吸收强度不同以 A作图next2 吸收光谱特征 定性依据吸收峰 max吸收谷 min肩峰 sh末端吸收 饱和 跃迁产生 图示 back 续前 3 生色团 发色团 能吸收紫外 可见光的基团有机化合物 具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和 电子的基团产生n 跃迁和 跃迁跃迁E较低例 C C C O C N N N 4 助色团 本身无紫外吸收 但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物 连有杂原子的饱和基团例 OH OR NH NR2 X 注 当出现几个发色团共轭 则几个发色团所产生的吸收带将消失 代之出现新的共轭吸收带 其波长将比单个发色团的吸收波长长 强度也增强 max 254nm 230 max 270nm 1250 5 红移和蓝移 由于化合物结构变化 共轭 引入助色团取代基 或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动 叫红移 长移 6 增色效应和减色效应增色效应 吸收强度增强的效应减色效应 吸收强度减小的效应7 强带和弱带 max 105 强带 min 103 弱带 吸收峰位置向短波方向蓝移 紫移 短移 四 吸收带类型和影响因素 1 R带 由含杂原子的不饱和基团的n 跃迁产生C O C N N N E小 max250 400nm max 100溶剂极性 max 蓝移 短移 2 K带 由共轭双键的 跃迁产生 CH CH n CH C CO max 200nm max 104共轭体系增长 max 红移 max 溶剂极性 对于 CH CH n max不变对于 CH C CO max 红移 例 max 1 己烯1771041 5 己二烯1782 1041 3 己二烯2172 1 1041 3 5 己三烯2584 3 104K吸收带是共轭分子的特征吸收带 可用于判断共轭结构 应用最多的吸收带 续前 3 B带 由 跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带 max 254nm 宽带 具有精细结构 max 200极性溶剂中 或苯环连有取代基 其精细结构消失 4 E带 由苯环环形共轭系统的 跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带E1180nm max 104 常观察不到 E2200nm max 7000强吸收苯环有发色团取代且与苯环共轭时 E2带与K带合并一起红移 长移 图苯在乙醇中的紫外吸收光谱 苯在 185nm和204nm处有两个强吸收带 分别称为E1和E2吸收带 是由苯环结构中三个乙烯的环状共轭体系的跃迁产生的 是芳香族化合物的特征吸收 在230 270nm处有较弱的一系列吸收带 称为精细结构吸收带 亦称为B吸收带 B吸收带的精细结构常用来辨认芳香族化合物 图示 E1185nm 50000E2204nm7400B254nm200 图示 小结 R带n 弱吸收K带 强吸收共轭B带 中吸收E带 强吸收 苯环 影响紫外可见吸收光谱的因素 1 共轭效应 共轭 中间有一个单键隔开的双键或三键 形成大 键 由于存在共轭双键 使吸收峰长移 吸收强度增加的这种效应 两个生色团处于非共轭状态 各生色团独立的产生吸收 总吸收是各生色团吸收加和 max 1 己烯1771041 5 己二烯1782 104 max 1 己烯1771041 3 己二烯2172 1 1041 3 5 己三烯2584 3 104 共轭状态 吸收峰向长波方向移动 吸收强度增加 醛 酮和羧酸中碳氧双键同烯键之间的共轭作用会使 轨道能量降低 从而使 跃迁和n 跃迁的吸收峰都发生红移 共轭效应越大 向长波方向移动越多 2 助色效应 n 共轭长移助色团与发色团相连时 助色团的n电子与发色团的 电子共轭 使吸收峰长移 吸收强度增加的这种效应3 超共轭效应 共轭长移烷基上的 电子与共轭体系中的 电子共轭 使吸收峰长移 吸收强度增加的这种效应例 max 217nm max 226nm 超共轭效应比共轭效应的影响小的多 4 空间位阻 立体和互变异构结构的影响 由于空间位阻 防碍两个发色团处在同一平面 使共轭程度降低 吸收峰短移 吸收强度降低的这种现象 从烷基取代硝基苯 偶氮苯顺反异构体的紫外吸收谱图 见下图 也可以清楚地看到空间阻碍对分子吸收光谱的影响 与硝基苯相比 2 4 6 三丁基硝基苯在255nm附近的吸收峰已经消失 偶氮苯反式异构体的摩尔吸光系数则远远大于顺式 且吸收峰位红移 互变异构 酮式 max 204nm烯醇式 max 243nm 共轭 5 溶剂效应 1 对最大吸收波长的影响随着溶剂极性的增大 跃迁吸收峰向长波方向移动 即发生红移 n 跃迁吸收峰向短波方向移动 即发生蓝移例 异亚丙基丙酮溶剂正己烷氯仿水极性越大 230nm238nm243nm长移n 329nm315nm305nm短移 2 对光谱精细结构和吸收强度的影响 当物质处于气态时 其振动光谱和转动光谱亦表现出来 因而具有非常清晰的精细结构 当它溶于非极性溶剂时 由于溶剂化作用 限制分子的自由转动 转动光谱就不表现出来 随着溶剂极性的增大 分子振动也受到限制 精细结构就会逐渐消失 合并为一条宽而低的吸收带 苯酚的庚烷溶液 苯酚的乙醇溶液 A nm 图示 back 第三节基本原理 一 Lamber Beer定律二 吸光系数和吸收光谱三 偏离Beer定律的因素四 透光率的测量误差 一 Lamber Beer定律 吸收光谱法基本定律 Lambert Beer定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度 C 和液层厚度 l 间的关系的定律 是光吸收的基本定律 是紫外 可见光度法定量的基础 透光率 T 吸光度 A Lambert Beer定律 当一束平行的单色光通过溶液时 溶液的吸光度 A 与溶液的浓度 C 和光程 b 的乘积成正比 A E C l 续前 透光率T与浓度C或厚度l成指数函数关系 吸光度A与浓度C或厚度l成正比关系 讨论 一 Lamber Beer定律的适用条件 前提 二 该定律适用于固体 液体和气体样品三 在同一波长下 各组分吸光度具有加和性应用 多组分测定 二 吸光系数和吸收光谱 1 吸光系数的物理意义 单位浓度 单位厚度的吸光度 讨论 1 E f 组分性质 温度 溶剂 当组分性质 温度和溶剂一定 E f 2 不同物质在同一波长下E可能不同 选择性吸收 同一物质在不同波长下E一定不同3 E 物质对光吸收能力 定量测定灵敏度 定性 定量依据 续前 2 吸光系数两种表示法 1 摩尔吸光系数 在一定 下 C 1mol L L 1cm时的吸光度2 百分含量吸光系数 比吸光系数 在一定 下 C 1g 100ml L 1cm时的吸光度3 两者关系 3 吸收光谱 吸收曲线 A 安络血的分子量为236 将其配成100ml含0 4962mg的溶液 装于1cm吸收池中 在入max为355nm处测得A值为0 557 试计算安络血的百分吸光系数和摩尔吸光系数 例题 解 A CL CL 故 A CL 0 557 0 4962 10 3 1 1122 531 100mL gcm 1 因 M 10 1122 531 236 10 26491 737 Lmol 1cm 1 续前 4 吸光度测量的条件选择 1 测量波长的选择 2 吸光度读数范围的选择 3 参比溶液 空白溶液 的选择 选A 0 2 0 7 注 采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收 光的散射和界面反射等因素对透光率的干扰 三 偏离Beer定律的因素 依据Beer定律 A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面 一 光学因素 二 化学因素 光学因素 化学因素 非单色光的影响杂散光的影响反射和散射光的影响非平行光的影响荧光物质的影响 溶液浓度的影响化学平衡的改变 一 光学因素 1 非单色光的影响 Beer定律应用的重要前提 入射光为单色光 照射物质的光经单色器分光后并非真正单色光其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱镜或光栅的分辨率决定为了保证透过光对检测器的响应 必须保证一定的狭缝宽度这就使分离出来的光具一定的谱带宽度 续前 2 杂散光的影响 杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内 与所选波长相距较远杂散光来源 仪器本身缺陷 光学元件污染造成杂散光可使吸收光谱变形 吸光度变值 3 反射光和散色光的影响 样品中的颗粒产生反射光和散色光均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响散射和反射使T A 吸收光谱变形注 一般可用空白对比校正消除4 非平行光的影响 使光程 A 吸收光谱变形 1 由于在高浓度时 通常C 0 01mol L 吸收质点之间的平均距离缩小到一定程度 邻近质点彼此的电荷分布都会相互受到影响 此影响能改变它们对特定辐射的吸收能力 相互影响程度取决于C 因此 高浓度可导致A与C线性关系发生偏差 1 溶液浓度的影响 2 摩尔吸光系数 与溶液折射率n有关 而溶液浓度过高会改变其折射率 从而使摩尔吸光系数发生改变 导致线性关系的偏离 Beer定律应用的另一重要前提 稀溶液 二 化学因素 例 在水溶液中 Cr 的两种离子存在如下平衡 2 化学平衡的改变 溶液中的溶质可因c的改变而有离解 缔合 配位以及与溶剂间的作用等原因而发生偏离L B定律的现象 Cr2O72 H2O 2CrO42 2H Cr2O72 与CrO42 有不同的A值 溶液的A值是二种离子的A之和 但由于随着浓度的改变 稀释 或改变溶液的pH值 Cr2O42 CrO42 会发生变化 使C总与A总的关系偏离直线 消除方法 控制条件 紫外 可见分光光度计是测量样品对入射光吸收的光谱仪 其工作原理为 由光源产生的连续辐射 经单色器后获得单色光 通过液槽中的待测溶液后 一部分被待测溶液所吸收 未被吸收的光到达光检测器 使光信号转变成电信号并加以放大 最后将信号数据显示或记录下来 第四节紫外分光光度计 紫外 可见分光光度计由光源 单色器 吸收池 检测器以及数据处理及记录 计算机 等组成 单色器 工作原理及仪器结构框图 光源 2 单色器单色器的作用是将来自光源的光按波长的长短顺序分散为单色光并能随意调节所需波长的光 主要由入射狭缝 准直镜 色散元件 物镜和出射狭缝组成 1 入射狭缝用于限制杂散光进入单色器 2 准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件 4 物镜将出自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝 5 出射狭缝用于限制通带宽度 3 色散元件把混合光分散为单色光 是单色器的关键部分 常用的色散元件有 棱镜 光栅 滤光片 光栅 具有周期性的空间结构或光学性能 如n t 的衍射屏 统称光栅 利用光的衍射作用和干扰作用使不同 的光有不同的方向 起到色散作用 光栅色散后的光谱是均匀分布的 光栅 棱镜 由玻璃或石英制成 它对不同 的光有不同的折射率 将复合光分开 但 光谱疏密不均 长 区密 短 区疏 棱镜 用棱镜和光栅作色散元件 分光性能好 能分出很窄的光谱通带 辐射纯度高 使用方便 棱镜的缺点是色散率随波长而改变 采用反射光栅作色散元件 可用于紫外 可见及红外光谱区 而且在整个波长区内具有几乎一致的分辨能力 各种波长同级谱线集合起来构成光源一套光谱 光栅光谱仪有几套光谱 如果光源发出的是具有连续光谱的白光 例如钨丝灯炮 则光栅光谱中除0级仍然近似白色的亮线外 其它级各色主级强亮线都排列成连续的光谱带 而棱镜只有一套光谱 这是两者的区别 3 吸收池 液池 样品池玻璃 能吸收UV光 仅适用于可见光区石英 不能吸收紫外光 适用于紫外和可见光区要求 匹配性 对光的吸收和反射应一致 000 000 续前 5 记录装置 讯号处理和显示系统 4 检测器 将光信号转变为电信号的装置 检测器简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器 目前最常见的检测器是光电倍增管 有的用二极管阵列作为检测器 光电倍增管的原理如右图 其特点是在紫外 可见区的灵敏度高 响应快 但强光照射会引起不可逆损害 因此高能量检测不宜 需避光 光电倍增管的外壳由玻璃或石英制成 内部抽真空 阴极涂有能发射电子的光敏物质 如Sb Cs或Ag O Cs等 在阴极C和阳极A间装有一系列次级电子发射极 即电子倍增极D1 D2 等 阴极C和阳极A之间加有约1000V的直流电压 当辐射光子撞击光阴极C时发射光电子 该光电子被电场加速落在第一倍增极D1上 撞击出更多的二次电子 依次类推 阳极最后收集到的电子数将是阴极发出的电子数的105 108倍 1 光电倍增管 光电倍增管光电倍增管是检测微弱光信号的光电元件 它由密封在真空管壳内的一个光阴极 多个倍增极 亦称打拿极 和一个阳极组成 通常两极间的电压为75 100V 九个倍增极的光电倍增管的总放大数为106 107光电倍增管的暗电流是仪器噪音的主要来源 阴极 阳极 光电二极管阵列检测器 photodiodearraydetector PDAD 80年代出现的一种新型检测器 这种检测器 一般是一个光电二极管对应接受光谱上一个纳米谱带宽度的单色光 例如 Waters生产的996型光电二极管阵列检测器 波长范围为190 800nm对应512个光电二极管 平均1 2nm谱带宽度由一个光电二极管接收 工作原理 当复光透过流通池后 被组分选择性吸收 透过光具有了组分的光谱特征 此透过光 复光 被光栅分光后 形成组分的吸收光谱 照射到光电二极管阵列装置上 使每个纳米光波的光强变成相应的电信号强度 因信号弱需经多次累加 而后给出组分的吸收光谱 这种记录方式不需扫描 因此最短能在几个毫秒的瞬间内获得吸收池中组分的吸收光谱 检测光路图 紫外 可见分光光度计 按其光学系统可分为单光束与双光束分光光度计 单波长与双波长分光光度计 原理 由光源发出的连续光谱 进入单色器经色散元件分光 获得的单色光分别通过参比溶液和样品溶液 进行光强度 吸收 的测定 三 紫外 可见分光光度计的类型 1 单光束分光光度计 单光束分光光度计只有一个光通道 分光后的单色光直接透过吸收池 交互测定样品池和参比池 结构简单 适用于测定特定波长的吸收 进行定量 但仪器受电源 光源 检测器等波动的影响较大 不能扣除这些波动的干扰 空白样品和待测样品单独测量 每换一个波长都要用空白溶液重新校正 不能准确地扣除空白值 原理 由光源发出的光通过单色器分光 将一束单色光从狭缝送出 经光束分裂器分成强度相等的两束光 一束通过参比池 另一束通过样品池 仪器测得的是透过样品溶液和参比溶液的光信号强度之比 比值即为试样的透光率T 经对数变换可转换为吸光度A 2 双光束分光光度计 PyeUnicamSP8 200紫外可见分光光度计光路图 优点 由于单波长双光束分光光度计一次测量可同时得到样品溶液相对空白溶液的透光度 因此双光束仪器可以消除光源强度变化和电源不稳定可能引起的误差 并且可以方便地对全波段进行扫描 仪器 样品室 缺点 仪器较单光束仪昂贵 要求待测样品与参比以及它们的吸收池完全匹配 更多的移动部分 原理 同一光源发出的光被分为两束 分别经过两个单色器后获得两束不同波长的单色光 利用切光器使两束光以一定的频率交替照射同一吸收池 根据比耳定律 样品溶液在两个波长为 1和 2的吸光度差值与溶液中待测物质的浓度成正比 3 双波长分光光度计 1 因为仅用一个样品池进行测量 不需要用参比吸收池 因此可以消除参比池与样品池的不同而引起的误差 2 对混浊样品进行测定时 可自动消除不同混浊度所引起的背景吸收 3 适当选择波长 简化混合组分同时测定过程 当试液中含有两种组分且光谱重叠时 用单光束进行分析 必须预先对试样进行萃取分离或加掩蔽剂消除干扰组分后才能进行测定 而使用双波长法则可选择干扰组分的波长测定结果做参比 自动扣除其影响 双波长分光光度法的优点 两用 双光束 双波长 紫外可见分光光度计 原理图 第五节定性和定量分析 一 定性分析二 定量分析 一 定性分析 一 定性鉴别 定性鉴别的依据 吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置 波长 吸收峰的强度相应的吸光系数 续前 1 对比吸收光谱的一致性 同一测定条件下 与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较 续前 2 对比吸收光谱的特征值 续前 3 对比吸光度或吸光系数的比值 例 标准品uv图 合成样品1uv图 合成样品2uv图 续前 二 纯度检查和杂质限量测定 1 纯度检查 杂质检查 1 峰位不重叠 找 使主成分无吸收 杂质有吸收 直接考察杂质含量2 峰位重叠 主成分强吸收 杂质无吸收 弱吸收 与纯品比较 E 杂质强吸收 主成分吸收 与纯品比较 E 光谱变形 续前 2 杂质限量的测定 例 肾上腺素中微量杂质 肾上腺酮含量计算2mg mL 0 05mol L的HCL溶液 310nm下测定规定A310 0 05即符合要求的杂质限量 0 06 二 定量分析 一 单组分的定量方法 1 吸光系数法2 标准曲线法3 对照法 外标一点法 续前 1 吸光系数法 绝对法 练习 例 维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207 用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0 414 求该溶液的浓度 见书P209例1 解 练习 例 精密称取B12样品25 0mg 用水溶液配成100ml 精密吸取10 00ml 又置100ml容量瓶中 加水至刻度 取此溶液在1cm的吸收池中 于361nm处测定吸光度为0 507 求B12的百分含量 解 练习 例 解 续前 2 标准曲线法 示例 芦丁含量测定 标准曲线的绘制根据紫外扫描图谱 见图1 取最大吸收波长620nm为测定波长 根据所得的吸光值 和相应的浓度 作线性回归 见图 图甘露糖及样品的紫外谱图Fig1UVspectraofD Mannoseandsample1甘露糖标准溶液 0 04mg ml 2样品溶液 得标准曲线回归方程为 7 757 0 0769 R2 0 9984 的单位为mg ml 续前 3 对照法 外标一点法 注 当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时 练习 例 维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2 50mL 加水稀释至10 00mL 另配制对照液 精密称定对照品25 00mg 加水稀释至1000mL 在361nm处 用1cm吸收池 分别测定吸光度为0 508和0 518 求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量 该B12注射液的标示量为100 g mL 见书P203例题 解 1 对照法 练习 2 吸光系数法 续前 二 多组分的定量方法 三种情况 1 两组分吸收光谱不重叠 互不干扰 两组分在各自 max下不重叠 分别按单组分定量 续前 2 两组分吸收光谱部分重叠 1 测A1 b组分不干扰 可按单组分定量测Ca 2 测A2 a组分干扰 不能按单组分定量测Ca 续前 3 两组分吸收光谱完全重叠 混合样品测定 1 解线性方程组法 2 等吸收双波长消去法 3 系数倍率法 1 解线性方程组法 步骤 2 等吸收双波长法 步骤 消除a的影响测b 续前 消去b的影响测a 注 须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大 3 系数倍率法 前提 干扰组分b不成峰形无等吸收点 续前 步骤 b曲线上任找一点 1另一点 2 优点 同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍 提高了待测组分测定灵敏度 练习 解 1 取咖啡酸 在165 干燥至恒重 精密称取1