马铃薯抗晚疫病鉴定技术规程

ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB 36/ XXXXXXXXX马铃薯抗晚疫病鉴定技术规程Code of practice for evaluation of potato resistance to late blight点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省质量技术监督局发布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14仪器与耗材15试验设计26接种鉴定方法27病情调查38抗性评价49接种后与材料的处理410鉴定记载表格4附录A（资料性附录）马铃薯晚疫病植株症状和病原菌生物学特性6前言本标准编写规则符合GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：何烈干、邹芬、马辉刚、涂玉琴、王美清、王修慧、朱跃冬、朱业斌、赖金美。6标准名称1 范围本标准规定了江西省马铃薯对晚疫病抗性鉴定的菌株选择、育苗管理、鉴定方法、病情调查和抗性评价标准等技术要求。本标准适用于江西省马铃薯品种（系）对晚疫病的抗性鉴定及评价。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 18133 马铃薯种薯GB/T 29379 马铃薯脱毒种薯贮藏、运输技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本部分。3.1 马铃薯晚疫病 potato late blight指由疫霉属致病疫霉Phytophthora infestans(Mont.)De Bary侵染马铃薯引起的一种流行性病害。3.2 生理小种 physiological race病原物种内或专化型内在形态上无差异但在寄主植物的品种上具有显著致病性差异的类群。3.3 接种体 inoculums用于接种以引起病害的病原物或病原物的一部分。3.4 抗性评价 evaluation of resistance levels根据采用的技术标准判别植物对特定病害反应程度和抵抗水平的描述。4 仪器与耗材4.1 仪器本鉴定技术规程中使用仪器包括：高压灭菌锅、显微镜、烧杯、漏斗、移液器、血球计数板、培养皿、打孔器、恒温培养箱、冰箱等。4.2 耗材本鉴定技术规程中使用耗材包括：黑麦、琼脂粉、番茄汁、碳酸钙、蔗糖、酒精、纱布、滤纸、育苗盆、营养钵等。5 试验设计5.1 育苗试验选在远离晚疫病发生的地带进行。供试马铃薯品种（系）选择纯度高、新鲜、无病虫、无损伤的脱毒马铃薯，将每个马铃薯品种的脱毒无菌试管苗于MS培养基中扩繁15株以上，在2325中光/暗(12h/12h)交替，光照强度为2003000lx培养20d后，移栽到装有蛭石混有羊粪的育苗盆或营养钵中，常规水肥管理，60d后用于接种鉴定。5.2 鉴定对照材料试验中设对照感病品种，选用23种当地历年易感晚疫病的马铃薯品种，具体育苗管理同5.1。6 接种鉴定方法6.1 病原物的分离供试病原菌为从江西露地栽培马铃薯病株中采集分离到，通过回接试验确定为马铃薯晚疫病菌，并经形态学鉴定为致病疫霉菌（Phytophthora infestans(Mont.)de Bary），保存备用。6.2 生理小种选择选择江西省优势马铃薯生理小种23个小种进行接种。6.3 培养基的制备黑麦培养基：取50 g黑麦种子在适量去离子水中浸泡24h36 h，捣碎机捣碎，5560水浴1h-2 h，经2层纱布过滤，上清液补水至1 L，加入琼脂粉15 g、番茄汁100 mL和碳酸钙0.1 g，121高压蒸汽灭菌20 min。6.4 接种体6.4.1 菌株的繁殖将马铃薯晚疫病菌菌株从保存的试管中移出活化后，置于黑麦培养基上培养10d，在菌落边缘打取直径0.5cm的菌饼，然后转接至经75%酒精表面消毒的新鲜健康感病薯块上，薯块厚度在0.5cm左右，置于消毒过的培养皿中，放入生化培养箱中1718培养4d7d，即可产生大量孢子囊，备用。6.4.2 孢子悬浮液的制备从薯片上挑取菌丝体和孢子囊放入少量无菌水中，用270目网筛过滤，在显微镜下用血球计数器测定滤液中孢子囊浓度，调整孢子囊数量为2000个/mL，然后放入4冰箱中静置4h，以保证游动孢子充分释放。6.5 取样从马铃薯植株中部上取大小一致的健康小叶叶片进行抗性鉴定，每个品种（系）取3040片叶片。6.6 人工接种采用离体叶片法进行接种。将所取叶片用无菌水冲洗3次，置于含1%水琼脂培养基的培养皿内，叶背朝上，用移液器吸取30uL游动孢子悬浮液接种到叶片中部叶脉的两侧，接种后放入1820的生化培养箱中黑暗培养，12h后将叶片翻转，置于光照培养箱中光/暗(12h/12h)交替培养。7 病情调查7.1 调查时间接种后第5d进行病情调查。7.2 调查方法观察叶片接种部位症状出现情况，调查具有典型晚疫病症状的叶片，测量其病斑面积和叶片面积，计算病斑面积占叶片面积的比率。用自制的透明方格板计算面积，每小格为0.25cm2，计数时，叶片或病斑边缘凡超过半格的算1格，不足半格的则不计数。7.3 病情分级标准根据分级标准记载病情，分级标准的划分详见表1。表1 马铃薯晚疫病接种鉴定分级标准病级病情病情指数抗性级别0级无病斑020.0高抗（HR）1级病斑面积5%2级5%病斑面积20%20.135.0抗（R）3级20%病斑面积40%35.150.0中抗（MR）4级40%病斑面积60%50.185.0感（S）5级60%病斑面积80%6级80%病斑面积85.1100.0高感（HS）7.4 病情记载按照表1所述植株的病情级别及其对应的病情描述，调查所有供试品种（系）的发病情况，记载每份品种（系）的病情级别，按公式（1）计算病情指数。病情指数（ID）=（各病级的叶片数病级数）100/调查总叶数6（1）8 抗性评价8.1 鉴定有效性判别当鉴定试验中对照感病品种叶片的发病率在60%以上时，该批次抗马铃薯晚疫病鉴定视为有效。8.2 抗性评价一次鉴定结果不可作为最终鉴定结果，应根据3次或以上抗性鉴定结果对鉴定材料进行抗病性评价。9 接种后与材料的处理将鉴定后的病株及病土进行消毒处理后方可丢弃。10 鉴定记载表格马铃薯抗晚疫病鉴定结果记载表格见表2。表2 马铃薯抗晚疫病鉴定结果记载表品种（系）叶片序号病斑面积（cm2）叶片面积（cm2）病级病情指数抗性级别123123AA附录A （资料性附录）马铃薯晚疫病植株症状和病原菌生物学特性A.1 植株症状马铃薯晚疫病（Potato Late Blight）由致病疫霉引起，导致马铃薯茎叶死亡和块茎腐烂的一种毁灭性卵菌病害。叶片染病先在叶尖或叶缘生水浸状绿褐色斑点，病斑周围具浅绿色晕圈，湿度大时病斑迅速扩大，呈褐色，并产生一圈白霉，即孢囊梗和孢子囊，尤以叶背最为明显；干燥时病斑变褐干枯，质脆易裂，不见白霉，且扩展速度减慢。茎部或叶柄染病现褐色条斑。发病严重的叶片萎垂、卷缩，终致全株黑腐，全田一片枯焦，散发出腐败气味。块茎染病初生褐色或紫褐色大块病斑，稍凹陷，病部皮下薯肉亦呈褐色，慢慢向四周扩大或烂掉。A.2 病原菌生物学特性马铃薯晚疫病病原菌为致病疫霉（Phytophthora infestans(Mont.)de Bary）。属于异宗配合卵菌，有A1和A2两种交配型。通常进行无性繁殖，但当A1和A2交配型同时存在时，二者可通过异宗配合进行有性生殖，产生有性生殖后代卵孢子。晚疫病菌在形态上可划分为菌丝、孢囊梗、孢子囊、游动孢子、休子孢和卵孢子。菌落白色，菌丝体由无色无隔菌丝组成，较宽，具有分支；孢囊梗节状，各节基部膨大而顶端尖细；孢子囊顶生或侧生，倒梨形或柠檬形，一端具半乳突，另端有小柄，易