科技探索之路　细胞工程的发展历程

植物细胞工程概述所谓细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品。细胞工程根据研究材料的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程，均主要由两部分构成。其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。第二则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。其中细胞培养是细胞工程的技术基础。顾名思义，植物细胞工程，是在细胞水平上针对植物细胞的细胞工程，它是细胞工程的一个重要组成部分。历程自1904年Hanning成功培养离体胚以来，伴随着相关理论与技术的飞速发展，植物细胞工程也取得了巨大的成就。现在，我们已经可以利用细胞融合及DNA重组等现代生物技术从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。1983年转基因植物问世，并于1986年起被批准进入田间试验，美国APHIS到97年1月31日已批准多达两千五百八十四例田间试验。不仅如此，一些转基因植物已经开始进行商业化生产。从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的转基因作物开始，其后截止至1997年1月，美国已批准十七例，加拿大十八例，澳大利亚四例，日本七例。我国农业部也已于97年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化。由此可见，植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响，我们应对此加以重视，了解一些新的研究成果及新技术，以求在生物工程这个二十一世纪的龙头产业中占有一席之地。操作与技术技术原理植物细胞具有全能性，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。而让细胞发挥出全能性的方法，就是细胞脱分化。细胞脱分化，就是让已经分化的细胞，经过诱导后，失去其特有的结构和功能而转变成为未分化细胞，进而形成愈伤组织。愈伤组织在一定的培养条件下，分化出幼根和芽，进而形成完整小植株，这就是愈伤组织再分化。培养技术植物细胞工程涉及诸多理论原理及实际操作技术，最重要的自然是培养技术，也就是将植物的器官、组织、细胞甚至细胞器进行离体地、无菌的培养。它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。此类技术发展起步较早，相对而言已比较成熟，各种培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类，每一种都还可可以继续细分为更具体的小类。组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织，另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板几类，它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养，以得到大量基本同步化的细胞，为遗传操作提供材料。花粉及花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织，从而产生单倍体植株。离体胚培养有幼胚与成熟胚培养两类，通过使用相应的培养基使离体胚正常的萌发生殖，以供研究和操作使用。原生质体的培养则是一切利用原生质体进行遗传操作的基础，它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，具体方法与细胞培养有一定的相似之处。作为后继操作的基础，培养技术的选择是非常重要的。采用适当的培养方法可以更好地进行遗传操作和保存细胞，而错误的选择是有可能影响结果甚至导致试验和生产失败，造成时间和金钱的浪费。改造细胞仅仅对细胞进行培养是不够，要使培养的细胞能为人类服务，就要对其进行一定的改造，这就涉及到了细胞的遗传操作。可以说，遗传操作是整个细胞工程中最为重要也最具挑战性的一环。它极大的依赖于理论原理、操作技术以及设备的发展。随着基因组学的发展，各项基因组计划正在紧锣密鼓地进行，由于DNA序列分析方法的革新，诸如高效毛细管自动化测序、DNA芯片法以及大规模平行实测法的应用大大加快了基因组计划的进程。拟南芥基因组计划将于2004年完成，水稻、番茄和玉米基因组的测序也正在进行。是类计划所提供的信息将不断定位大量有价值的基因，而最近的研究还表明影响作物产量的可以是单基因的改变而不仅仅是多基因决定。所有这一切的基础研究都为遗传操作提供了更多、更准确的理论依据。实验技术的发展则使精确、高效的遗传操作变得更加方便。将外源DNA导入靶细胞的方法不断完善，除了以前经常使用的质粒载体、病毒载体、转座因子和APC（酵母人工染色体）等途径外，通过lipoplexpolyplex介导、裸DNA、基因枪、超声波法和电注射法等非病毒方式转换细胞的方法也开始被广泛的使用；细胞融合方法已被不断的改进，融合率增大；细胞诱变也取得了较大的进展，诱变方式不断增加。这些理论和技术的发展都为更好的改造细胞创造了条件。培养或改造好的细胞是进行研究和生产的基本材料，为了使其不致死亡并尽量保持优良的特性，就需要进行适当的保藏。一般是根据细胞的特点，人工创造条件使其生长代谢活动尽量降低，处于休眠状态，以抑制增殖和减少变异。作为世界上最大的细胞库，ATCC早在92年就已经有了三千两百多个细胞系入库，而且数量还在不断增加。此外还有CSH(美)、NCTC(英)、NRRL(英)、KCC(日)等著名的保藏机构，国内也有一些较为大型的机构，足见各国对细胞保藏的重视。由于植物细胞有其自身的特点，因而其保藏方法不可能与微生物完全相同。通常采用的方法是液氮超低温保藏方法。这种方法利用液氮的温度可以达到-196，远远低于一般细胞新陈代谢作用停止的温度（-130）从而使细胞的代谢活动停止，化学作用随之消失，达到长期保藏的目的。操作时要注意从常温到低温的过渡，以使细胞内的自由水通过膜渗出，避免其产生冰晶而损害细胞。另外还有低温冻藏法及其他一些保藏方法，但多用于短期保藏。目的细胞工程的目的，是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物，就必须依靠下游加工过程，也就是我们常说的下游工程。它的作用就是大量培养细胞，并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。由于植物细胞的高度易碎性，对剪切力的敏感、细胞有去分化和聚集作用，增殖时间长等独特性，使其大规模培养技术明显比微生物和动物细胞的发展缓慢。但通过不懈的努力，现在已经具备在2万升规模的生物反应器中培养烟草细胞的能力。而日本的三井石化也已经在使用750L发酵罐通过培养植物细胞而生产紫草宁，且产量较高，可满足全日本百分之四十上的需要。相信随着理论以技术的不断完善，植物细胞的大规模的培养将会很快的成为一种常规的生产手段。培养后的培养物经过处理后被分离、提纯。分离和精制过程所需的费用在整个生产过程中的占有很大的比例，一般为60%，有些甚至高达80-90%，而且还有继续加剧的取向。因此该过程的落后也可能阻碍细胞工程的发展。世界各国现在已经都比较重视这个问题，英国早在83年就发起了生物分离计划(BIOSEP)，专门研究分离与精制，我国也曾经召开过专门会议。分离