第二章 微生物的纯培养和显微技术.ppt

第二章微生物的纯培养及显微技术 MicrobialPureCluture TheMicroscopicTechnique 第一节微生物的分离和培养 培养物 Cluture 在一定条件下培养 繁殖得到的微生物群体混合培养物 MixedCluture 含多种微生物的培养物 纯培养物 PureCluture 只有一种微生物的培养物 纯培养技术是进行微生物学研究的基础 通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果 在研究中所使用的微生物培养群体 无菌技术用固体培养基分离纯培养用液体培养基分离纯培养单细胞 单孢子 分离选择培养分离微生物的保藏技术 一 无菌技术 在转接 培养微生物室防止其他微生物的污染 其自身不污染操作环境 在分离 转接及培养纯培养 物 时防止其被其他微生物污染的技术 用于分离 培养微生物的器皿事先不含任何微生物 幻灯片5 1 微生物培养的常用器具 试管 三角瓶 培养皿等 2 保持无菌的方法高压蒸气灭菌 最常见 高温干热灭菌棉塞超净工作台无菌接种 高压灭菌锅 接种操作火焰 酒精灯等 附近 超净工作台 二 用固体培养基获得纯培养 菌落 cloney 单个 或聚集在一起的一团 微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长 繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的 有一定形态结构的子细胞生长群体 众多菌落连成一片 菌苔 lawn 各种微生物形成的菌落特征 同一细菌在不同培养基上形成不同菌落特征 平板分离微生物纯培养技术 原理及方法 稀释倒平板法涂布平板法平板划线法稀释摇管法 1 稀释倒平板法 倾注平板法pourplatemethod 无菌水 梯度稀释 50 55 左右的琼脂培养基 灭过菌的培养皿 注意要稀释得当 分离出单个菌落以后 重复上述操作数次 便可得到纯培养 十倍稀释法 优点 适合分离和计数目的局限 操作麻烦 不合适热敏感菌 不适合严格好氧菌 同一微生物 培养基内外形成菌落形态差异 2 涂布平板法 spreadplatemethod 无菌水 梯度稀释涂布平板Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterileglassrod 优点 简单易行 常规用法局限 涂布不均与 易造成机械损伤 稀释倒平板法 涂布平板法 3 平板划线法 streakplatemethod Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar 划线方法 特点 快速 方便 分区划线 适用于浓度较大的样品 连续划线 适用于浓度较小的样品 厌氧罐 4 厌氧微生物的分离 厌氧手套箱 密封容器除氧方法 生物方法与需氧微生物共同培养物理方法抽气法 将培养物置真空干燥器中抽真空 再培养 充气法 把培养物放一密闭贮器中充入N2 排尽空气 化学方法化学吸氧法 利用化学反应耗氧达到形成厌氧环境的目的 用焦性没食子酸 1g 与NaOH 10 反应除氧 100ml空气中的O2 密闭容器中利用硫磺或磷的燃烧耗氧形成厌氧环境NaHSO3 NaCO3混和反应耗氧培养基预还原法培养基中加入还原剂 半胱氨酸 Na2S Vc 再隔绝空气培养 适于培养专性厌氧菌 稀释摇管法 shaketubemethod 用于分离严格厌氧菌 试管培养基融化 50 保温 样品梯度稀释后加入试管培养基中 摇匀冷却凝固 石蜡油封闭 培养 特点 严格厌氧菌分离技术 适用缺乏专业设备的情况局限 观察和挑取菌落难 三 用液体培养基获得纯培养 用于细胞大的细菌 原生动物和藻类等的纯化分离 稀释法 经高度稀释后 同一个稀释度的试管中大多数 95 以上 表现不生长 很可能得到的是纯培养 四 显微单细胞 单孢子 分离法 适合混合菌中的少数菌 一般采用显微操作仪 在显微镜下进行 操作难度与细胞或个体大小成反比 毛细管法 用毛细管提取微生物个体 适合于较大微生物 显微操作仪 用显微针 钩 环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养 小液滴法 将经适当稀释后的样品制成小液滴 在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物分离 五 选择培养分离 当微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化 使待分离的微生物在群落中数量上升 方便用稀释法对其进行纯化 使待分离的微生物生长 突出 直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养 抑制大多数其他微生物的生长 使待分离的微生物生长更快 高温条件下分离高温菌 培养基添加抗生素 分离抗性菌 培养基中不含N 分离固氮菌 1 利用选择平板进行直接分离 2 富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同 制定特定的环境条件 使仅适应于该条件的微生物旺盛生长 从而使其在群落中的数量大大增加 人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物 如果要从环境中分离得到仅能够利用苯作为碳源和能源的微生物纯培养物 你该如何设计实验方案 1 富含苯采样 2 十倍稀释 3 培养 富集或直接筛选 4 对照培养 利用空气中的CO2的自养型微生物 二元培养物 纯培养物 只有一种微生物的培养物 混合培养物 含有两种以上微生物的培养物 二元培养物 只含两种微生物且有意识地保持二者之间特定关系的培养物 病毒和宿主细胞 六 微生物的保藏技术 影响微生物菌种稳定性的因素 a 变异b 污染c 死亡基本要求 在一定时间内使菌种不杂 不乱 不衰 不退 基本原理 菌种 优良纯种 最好是休眠体 手段 低温 缺氧 缺乏营养 添加保护剂等环境 生长受到抑制 难以突变 1 传代培养保藏法是微生物保存的基本方法 琼脂斜面 半固体琼脂柱和液体培养等 橡皮塞封口或用石蜡覆盖 并放置低温保存4 6 保存 斜面低温保藏法原理 低温方法 将菌种接种在新鲜斜面培养基上 适温培养至生长完全 4 冰箱保藏 每隔一段时间移接一次优点 适用于各种微生物 简便易行 易于观察 缺点 保藏时间短 传代次数多 易变异 易污染 保藏时间 霉4个月酵4 6个月放3个月细1 2个月 改良方法 橡皮塞取代棉塞 加矿油 2 石蜡油封藏法原理 低温 缺氧方法 将无菌石蜡油注入生长良好的斜面种试管内 油量高出斜面1cm 包扎后竖直放入冰箱保藏 说明 保藏时间1 2年 斜面培养基能干燥则保藏效果好 适于各种微生物 尤其适合丝状真菌和担子菌能同化和敏感烃类的微生物不宜用此法 3 砂土管保藏法 干燥 载体保藏 原理 干燥 缺氧方法 取河砂若干 24目过筛 10 HCl浸泡24h 水洗至中性 烘干后分装安瓿瓶或试管 加棉塞 灭菌 无菌检查 每管加孢子悬液 接种环拌匀 干燥器中干燥 火焰熔封或蜡封 干燥器中保藏说明 适于保藏霉菌和放线菌孢子及芽孢杆菌时间2 10年 一般细菌芽孢常用砂土管保藏 霉菌的孢子多用麸皮管保藏 一般细菌芽孢常用砂土管保藏 霉菌的孢子多用麸皮管保藏 一般细菌芽孢常用砂土管保藏 霉菌的孢子多用麸皮管保藏 一般细菌芽孢常用砂土管保藏 霉菌的孢子多用麸皮管保藏 4 液氮超低温保藏法 冷冻保藏法 原理 低温方法 将菌种置于保护剂中 预冻后保存在液氮超低温冰箱中 196 优点 适用于各种微生物的较理想的保藏方法 缺点 专门的设备 运输过程比较麻烦 操作要求 5 真空冷冻干燥法原理 低温 干燥 真空 缺氧 方法 将菌种用保护剂制成菌悬液 先在极低温度下快速冷冻 再在极低的温度下抽真空干燥 使其中的水分直接升华为水蒸汽 以达干燥的目的 常用的细胞保护剂 血清 脱脂牛奶 淀粉 葡聚糖优点 适用各种微生物 便于大量保藏 可避免污染变异率低 菌种存活时间长 几到几十年 缺点 操作过程复杂 需要一定的专业设备 几种常用菌种保藏方法的比较 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种 菌株 并加以妥善保管 使之达到不死 不衰 不乱以及便于研究 交换和使用的目的 菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会 CCCCM 美国的典型菌种保藏中心 ATCC 英国国家典型菌种保藏所 NCTC 法国里昂巴斯德研究所 IPL 国内外菌种保藏机构 七 菌种的衰退与复壮 1 菌种的衰退衰退 degeneration 菌种在培养或保藏过程中 由于自发突变的存在 出现某些原有优良生产性状的劣化 遗传标记的丢失等现象 称为菌种的衰退 常见的衰退现象 菌落和细胞形态的改变 生长速度缓慢 产孢子越来越少 抵抗力 抗不良环境能力减弱 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降等 2 衰退的原因 基因突变 分离现象 3 防止菌种衰退的方法采用不同类型的细胞进行传代 对丝状微生物而言 通常采用稳定的单核孢子进行接种 选择合适的培养条件控制传代次数 一般在DNA的复制过程中 碱基的错配率是5x10 4 自发突变的频率为10 8 10 9 采用良好的菌种保藏方法 可以减少移种和传代的次数 采用有效的菌种保藏方法 4 菌种的复壮 rejuvenation 使衰退的菌种恢复原来优良性状 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下 通过纯种分离和生产性能测定等方法 从衰退的群体中找出未衰退的个体 以达到恢复该菌原有典型性状的措施 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常 进行纯种的分离和生产性能测定工作 以期菌种的生产性能逐步提高 菌种的复壮措施 纯种分离 平板划线法 涂布法 倾注法 单细胞挑取法等 通过寄主体内生长进行复壮 如Bacillusthuringiensis的复壮 淘汰已衰退的个体 采用比较激烈的理化条件进行处理 以杀死生命力较差的已衰退个体 采用有效的菌种保藏方法 第二节显微镜的种类及显微技术 了解 显微镜的种类及原理显微观察样品的制备 一 显微镜的种类及原理 普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜 光学显微镜 原理利用物镜和目镜的多组凸透镜将物象逐渐放大并放射到视网膜的过程 分辨率 肉眼分辨率一般只有0 25mm光学显微镜分辨率0 18 m电子显微镜可达0 2nm d 0 5 sin 式中 n 介质折射率 镜口角 标本对物镜镜口的张角 sin 镜口率 普通生物显微镜由三部分构成 机械装置 保证光学系统的准确配制 用于固定材料和观察方便 照明系统 包括光源和聚光器 光学放大系统 由物镜和目镜组成 是显微镜的主体 为了消除球差和色差 目镜和物镜都由复杂的透镜组构成 二 实验原理 机械装置 光学装置 聚光器 聚光器透镜 虹彩光圈 升降螺旋 显微镜的放大倍数 物镜放大倍数 目镜放大倍数 显微镜使用的方法原因分析 明视野显微镜明视野显微镜即常用的普通光学显微镜 生活的细菌在明视野显微镜下观察是透明的 不易看清 解决的措施 一方面是对观察的样品进行改造 发展出各种染色技术 通过特殊的染色方法使细胞着色 增加与背景的反差 便于观察 另一方面进行显微镜的改造 由此发展出不同种类的显微镜 适用于不同的观察目的 2 暗视野显微镜暗视野显微镜是应用了特殊聚光器 只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜 因而视野的背景是黑的 物体的边缘是亮的 应用 生活细菌运动性观察 特点 只能看到物体的存在与运动 不能辨清其微细结构 3 相差显微镜光波的长短表现为颜色差别 光的振幅高低表现为明亮程度的不同 观察样品各部分厚薄 密度不同 光线通过时直射光和衍射光的光程产生差别 导致出现相位差 相差显微镜配备了特殊的光学装置 利用光的干涉现象 将光的相位差转变成人眼可辨的振幅差 明暗差 形成反差 从而提高了各种结构间的对比度 使各种结构变得清晰可见 应用 观察活的细胞以及细胞内的一些细微结构 4 荧光显微镜紫外线光源照射在具有荧光素的样本上 激发出荧光 使标本在暗的视野中显现出光亮的物体 不同的荧光素还表现为不同的颜色 由此可以进行定性和定量的研究 应用 生物组织 生理 病理 微生物 医药 食品 化学等诸方面的鉴定等 电子显微镜与光学显微镜的差异 1 以电子波 波长最短可达到0 005nm 代替光源 电镜实际的分辨率比光镜提高约1000倍 2 电镜镜筒中要求高真空 所以很难观察活的生物 3 以电子透镜 电磁圈 代替光学透镜 4 电子像人肉眼看不到 需用荧光屏来显示或感光胶片作记录 电子显微镜按结构和用途可分为 透射电子显微镜 transmissionelectronmicroscope 电子束穿过薄切片扫描电子显微镜 scanningelectronmicroscope 观察样品的表面结构 二 显微观察样品的制备 要根据显微镜和样品的特点来制备主要讲述光学显微镜的制样 1 活体观察 压滴法 将菌悬液滴于载玻片上 加盖盖玻片后立即进行显微镜观察 悬滴法 在盖玻片中央加一小滴菌悬液后反转置于特制的凹载玻片上后进行显微镜观察 为防止液滴蒸发变干 一般还应在盖玻片四周加封凡士林 菌丝埋片法 将无菌小块玻璃纸铺于平板表面 涂布放线菌或霉菌孢子悬液 经培养 取下玻璃纸置于载玻片上 用显微镜对菌丝的形态进行观察 插片法 2 染色观察 固定的目的 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上 增加细菌对染料的亲和力 常用的方法有酒精灯火焰加热和化学固定二种 细菌染色法 死菌 正染色 负染色 荚膜染色法等 简单染色法 鉴别染色法 革兰氏染色法抗酸性染色法芽孢染色法姬姆萨染色法 活菌 用美蓝或TTC 氯化三苯基四氮唑 等作活菌染色 染色观察 第三节显微镜下的微生物 原核微生物 指细胞核无核膜 无核仁 没有染色体 不进行有丝分裂的微生物 真核微生物 指具有完整的细胞核 有核仁 核膜 染色体 能进行有丝分裂的微生物 一 细菌和古生菌 定义 细菌是一类细胞细而短 细胞直径约0 5um 长度约0 5 5um 结构简单 细胞壁坚韧 以二等分裂方式繁殖和水生性较强的原核微生物 生存环境 温暖潮湿 富含有机物的地方 都有大量细菌活动 有特殊的臭味或酸败味 发粘 发滑 1 细菌的形态和排列 1 球菌 形状 球形 独存 或近似球形 几个连在一起 稍扁 大小 0 5 1 m分裂与排列 单球菌 细胞分裂沿一个平面进行 新个体分散而单独存在 如尿素微球菌 Micrococcusureae 细胞沿一个平面分裂 新个体成对排列 如肺炎双球菌 Diplococcuspneumoniae 双球菌 细胞沿一个平面进行分裂 新个体不但可保持成对的样子 并可连成链状 如 乳链球菌 Streptococcuslactis 无乳链球菌 Streptococcusagalactiae 溶血链球菌 Streptococcushemolyticus 链球菌 细胞分裂是沿两个相垂直的平面进行 分裂后每四个细胞特征性地连在一起 呈田字形 如四联微球菌 Micrococcustetragenus 四联球菌 细胞按三个互相垂直的平面进行分裂后 每八个球菌特征性地连在一起成立方体形 如藤黄八叠球菌 Sarcinaureae 八叠球菌 细胞无定向分裂 多个新个体形成一个不规则的群体 犹如一串葡萄 如金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 白色葡萄球菌 Staphylcoccusalbus 葡萄球菌 杆菌是细菌中种类最多的类型 因菌种不同 菌体细胞的长短 粗细等都有所差异 杆菌的形态 短杆状 长杆状 棒杆状 梭状杆状 月亮状 竹节状等 短杆菌 2 杆菌 bacillus 及其排列状态 大肠杆菌 长杆菌 梭状芽孢杆菌 大小 1 5 m 0 5 m形状 主要杆状或圆柱形 其它 青烟状 弧状 胡萝卜状 大脑骨状 分枝状 丝状分裂 二分分裂 折断分裂断面不规则 子细胞大小不一 出芽分裂排列 链状 栅栏状 八 字状 分散随机排列Bacterialshape 链状 2 杆菌的排列状态 X V或Y型 栅栏状 3 杆菌端部特征 1 大肠杆菌 钝圆 肉毒梭菌 梭状 炭疽杆菌 平截 杆菌是细菌中种类最多的 工农业生产中所用的细菌大多是杆菌 如淀粉酶 蛋白酶生产菌 枯草杆菌 谷氨酸生产菌 北京棒杆菌 细菌肥料 根瘤菌 杀虫剂 苏云金杆菌 致病菌 伤寒沙门氏菌 痢疾志贺氏菌等 3 螺旋菌 spirilla 螺旋状的细菌称为螺旋菌 根据其弯曲情况分为 弧菌 vibrio 螺旋不满一圈 菌体呈弧形或逗号形例 霍乱弧菌 逗号弧菌螺旋菌 spirillum 螺旋满2 6环 螺旋状例 干酪螺菌螺旋体 spirochaeta 旋转周数在6环以上 菌体柔软 例 梅毒密螺旋体 Vibriocholerae 4 特殊形状的细菌 柄细菌 肾形菌 臂微菌 网格硫细菌 贝日阿托氏菌 丝状 具有子实体的粘细菌等是特殊形态的细菌 粘细菌 柄细菌 臂微菌 肾形菌 网格硫细菌 贝日阿托氏菌 影响细菌形态的因素 培养时间 培养温度 培养基成分 浓度 pH值 结核杆菌的正常形态 结核杆菌的异常形态 二 细菌的大小 1 测量 测微尺 2 长度单位 微米 m 3 表示 球菌 直径杆菌 宽 长螺菌 宽 长 螺距 通常球菌直径 0 2 1 5 m 杆菌 长1 5 m 宽0 5 1 m 例如 E coli 平均长度 2 m 宽度0 5 m1500个大肠杆菌头尾相接等于3mm 109个大肠杆菌重1mg 细菌大小举例 2 古生菌 自学 与细菌有着类似的个体形态 但多生活在极端环境中如高温 高盐等 二 真菌 霉菌酵母菌 1霉菌 molds 霉菌 mould 是一些丝状真菌的通称 并不是分类学上的名称 在自然界分布很广 大量存在于中性或偏酸性土壤中 概念分类位置分布应用危害 1 霉菌 霉菌即丝状真菌 有分枝与不分枝 无隔菌丝 根霉 毛霉 与有隔菌丝 青霉 曲霉 之分 菌丝体 由许多菌丝交织在一起而组成 在固体培养基上 真菌菌丝可分为 营养菌丝 气生菌丝和繁殖菌丝 霉菌菌丝类型 按分化程度分 依形态分 1 营养菌丝 Vegetatilehypha 在固体培养基上伸入基内的菌丝 行吸收养料之功能 2 气生菌丝 Aerialhypha 向空中生长的菌丝 发育到一定阶段可分化成孕育 繁殖 菌丝 Reproductivehypha 霉菌 青霉 的菌丝 霉菌菌丝类型 依形态分 按分化程度分 无隔菌丝 为长管状单细胞 细胞质内含多个核 其生长表现为菌丝的延长和细胞核的增多 这是低等真菌所具有的菌丝类型 有隔菌丝菌丝中有隔膜 被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞 菌丝由多个细胞组成 每个细胞内有一至多个核 隔膜上有单孔或多孔 细胞质和细胞核可自由流通 每个细胞功能相同 这是高等真菌所具有的类型 菌落特征 霉菌的菌落大 疏松 干燥 不透明 多呈绒毛状 絮状或网状等 菌体可沿培养基表面蔓延生长 由于不同的真菌孢子含有不同的色素 所以菌落可呈红 黄 绿 青绿 青灰 黑 白 灰等多种颜色 液体培养时的特征 如果是静止培养 菌丝往往在液体表面生长 液面上形成菌膜 如果是震荡培养 菌丝可相互缠绕在一起形成菌丝球 亦可形成絮片状 与震荡震荡速度有关 霉菌的培养特征 2 重要的代表霉菌 与人类的关系非常密切 日常生活中衣物 食品的发霉现象 酿酒 根 制酱 曲 做腐孔 毛霉 生产抗生素等 霉菌是人们在实践活动中认识最早并加以利用的一类微生物 2酵母菌 yeast 酵母菌是一类单细胞真菌的俗称 分类学上分属于子囊菌纲和半知菌类 特征 1 个体一般以单细胞状态存在 2 多数营出芽生殖 有的裂殖 3 能发酵糖类产能 4 细胞壁常含有甘露聚糖 5 喜在含糖量较高 酸度较大的水生环境中生长 分布 偏酸性的含糖环境 水果 蔬菜 蜜饯的表面 果园土壤中与环境有关 酵母菌与人类的关系极其密切 1 酵母菌的形态和大小 细胞直径比细菌粗10倍左右 1 5 m 5 30 m 因此在光学显微镜下可以模糊地看到它们细胞内的各种结构分化 酵母菌细胞的形态通常有球状 卵圆状 椭圆状 柱状 香肠状及假丝状等多种 酵母菌用途 主要用途有 食品中 有益 酿酒 发面制馒头和面包食用或饲料用 SCP有害 使果汁 果