实验五 叶绿体的分离.doc

山东大学实验报告 2013年3月12 日 姓名 李某某 系年级 同组者 科目 细胞生物学实验 题目 叶绿体的分离、纯化与荧光观察 学号 201100140000【实验目的】 1、通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。【实验原理】1.叶绿体分离原理匀浆破碎细胞，利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。差速离心：颗粒在离心场中的沉降速度取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的密度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度不同，先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液中（0.35mol/L的氯化钠或0.4mol/L的蔗 糖溶液）进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。分离过程最好在05的条件下进行，如果在室温下，要迅速分离和观察。2、差速离心特点：1.介质密度均一；2.速度由低到高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞核、细胞器。沉降顺序：细胞核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高尔基体核蛋白体。可将细胞器逐步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。3、密度梯度离心密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成连续的密度梯度，将细胞悬浮液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力的作用使细胞或细胞器分层、分离，最后不同密度的细胞或细胞器位于与自身密度相同的沉降区带中，这种离心技术又可分为速度沉降和等密度沉降两种，速度沉降主要用来分离密度相近而大小不同的物体，而等密度沉降用于分离密度不同的物体。叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的，由于具有这一重要功能，所以它一直是植物生物学、细胞生物学和分子生物学的重要研究对象，叶绿体是一种比较大的细胞器，利用差速离心即可分离收集，然后用密度梯度离心纯化，便可用于各种研究。4、吖啶橙（1）探针特性AO是三环杂芳香类荧光探针，既可以标记DNA，又可以标记RNA，用蓝光激发后能够发出绿、红两种荧光。AO与核酸的结合分为强结合方式和弱结合方式两种：一种是嵌入核酸双链的碱基对之间，另一种是与单链核酸的磷酸发生静电间相互作用。强结合方式：又称插入性方式，AO分子插入在双链核酸的碱基对之间，它们的结合能量为610kcal/mol探针，插入后的探针分子与核酸结合更加稳定，每插入一个AO分子，双链结构即发生26度旋转，这样在一个位点上就限制了AO分子与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，呈绿色荧光。弱结合方式：即静电吸引结合方式，带正电荷的AO分子与带负电荷的磷酸根结合，每个磷酸根的位点上均可结合一个AO分子，最大结合率为1:1，这种结合方式主要是AO分子与RNA分子的结合，其发射波长为640nm，呈红色荧光。AO与核酸的结合方式在低浓度下最佳，此时插入性结合方式占优势。（2）AO的主要应用：1.对细胞内单链或双链DNA/RNA定性和定量。2.分析核酸内部结构及含核酸的细胞成分构象。3.观察DNA凝胶电泳情况。4作为细胞内PH梯度显示剂，用来检测离子交换，钙离子通道的质子梯度变化等。5、荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态到基态时，可以电磁辐射的方式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。紫外辐射、可见光及红外辐射均可引起光致发光，如磷光与荧光。荧光：在光致发光中，如果一定波长的短波光（如紫外光）照射某种物质，这种物质吸收光能后进入激发态，并且立即退激发在极端的时间内能发射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光称为荧光，一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。荧光分为自发荧光或诱发荧光（次生荧光、续发荧光、间接荧光）。某些物质受激发光照射后可直接发出荧光，如叶绿素、血红素的火红色荧光或木质素的黄色荧光等，称为自发荧光。某些物质本身不发荧光，但它经荧光染料染色后，再通过紫外线照射同样也能发出荧光，这种荧光称为诱发荧光，如叶绿体被吖啶橙染色后可发橘红色荧光。6、荧光的性质1.吸收光，必须有激发光源。2.荧光波长激发波长（损失热能）。3.荧光强度极小于激发光的强度。4.有不同程度的衰减（影响因素：如温度、光、淬灭剂等，先拍照后观察）。5.荧光强度取决于激发光强度、被捡物浓度、荧光效率（在制作荧光纤维标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油）。7、荧光显微镜的操作及注意事项（1） 接通电源，打开启动装置开关；（2） 按starter按钮35秒以启动激发光源，注意：按starter按钮不能超过5秒，启动23分钟后方可稳定，启动15分钟内不得关闭电源，一旦关闭汞灯，3分钟内不得重新启动，用完后关闭main switch；（3） 光路对中（换灯泡时进行）；（4） 选择相对应的激发滤片、阻断滤片和双色滤片；（5） 放置样品，先在普通光镜下选好要观察的视野；（6） 关闭普通光源后扯开UV挡板，即可观察到样品的荧光情况；（7） 需照相时，要及时拍照，否则可能拍不到荧光照片；（8） 观察结束后，关闭main switch，切断电源。8、荧光显微镜的工作原理荧光显微镜(Fluorescence microscope) ： 荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间有必要时立即拍照。 另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上； 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。【实验材料】1. 材料新鲜菠菜2. 试剂 0.35 molL氯化钠溶液， 0.01吖啶橙(acridine orange)3. 器材普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜、光学显微镜、烧杯、量筒、滴管、离心管、纱布若干、无荧光载片和盖片。【实验步骤】1 选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后，去除叶梗及粗脉并剪碎，称30g放于150ml 0.35 molL NaCI溶液中。2 将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆35分钟，转速5 000 rmin。3 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4 取滤液4ml在1000 rmin下离心2 min,弃去沉淀。5 取上清液在3000 rmin下离心5min（沉淀即为叶绿体和细胞核混合物）。6 将沉淀用23mL0.35 molL NaCl溶液悬浮。7 取叶绿体悬液一滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察： 在普通光镜下观察；在荧光显微镜下观察； 取叶绿体悬液半滴滴在无荧光载片上，再滴加半滴001吖啶橙荧光染料，用盖玻片一端搅动液体，混匀，加无荧光盖片后即可在荧光显微镜下观察。【实验结果】在普通光学显微镜下，叶绿体呈绿色，形状为橄榄形（图1），高倍镜下可看到基粒（深绿色小颗粒）。在荧光显微镜下，叶绿体自发荧光为“火红色”，背景为黑色如图2所示。加入吖啶橙染液后，叶绿体可以发出“橘红色”次生荧光，细胞核则发出绿色荧光。叶绿体 图1. 普通光学显微镜下的叶绿体（1010）荧光叶绿体图2. 荧光显微镜下的叶绿体【实验结果分析】本次实验主要进行的是叶绿体的分离纯化，以及在荧光显微镜下的观察，首先在显微镜下观察叶绿体悬液，叶绿体呈浅绿色的椭球形，周围还有一些其他物质，可能是核碎片等杂质。在荧光显微镜下，叶绿体显示为火红色，别经有点淡绿色，这是载玻片的杂质发荧光的原因。再用吖啶橙染色，叶绿体显示为橘红色，其