【基金】2010CB933900-应用纳米技术解决胃癌预警与早期诊断中的关键科学问题

项目名称：应用纳米技术解决胃癌预警与早期诊断中的关键科学问题首席科学家：崔大祥 上海交通大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部 上海市科委一、研究内容主要研究内容：（1） 纳米粒子制备及其与胃癌标志物间的相互作用 纳米粒子可控合成与仿生构建利用高分子化学和有机合成化学的方法和原理，设计水溶性好、靶向性强、生物安全性高、环境友好型纳米粒子材料，如树形分子修饰的金纳米棒、二氧化硅包裹的荧光磁性纳米粒子与荧光碳纳米管，并对其结构进行表征。 胃癌分子标志物的制备、活性鉴定与表征利用分子克隆与蛋白表达分离纯化等技术手段，设计并制备一批胃癌相关基因寡核苷酸探针，然后与纳米材料组装在一起，制备出系列纳米胃癌基因探针；制备出一系列胃癌相关蛋白的抗体，获取抗体Fab功能片段，制备成胃癌抗体探针；然后对活性进行鉴定并表征；利用纳米颗粒本身的结构特点，利用细胞生物学等技术，筛选出高效、靶向的胃癌分子探针，并对胃癌分子探针组装方式、性质进行研究。 胃癌相关分子标志物的筛选与纳米探针的制备与表征：选择的胃癌相关分子标志物如brcaa1,ndr2,UAG4,gcys-20,HAI-178，等。纳米载体选择羧基化的树形分子修饰的金纳米棒，荧光磁性纳米粒子，荧光碳纳米管等，把分子标志物与纳米载体连接，制备成纳米探针；采用高分辨电镜、原子力学显微镜、Zeta电位、免疫共沉淀方法进行表征。 纳米探针与胃癌相关分子标志物相互作用调查表面基团种类、性质、密度对固定探针特异性与灵敏度的影响，采用原子力学显微镜测量纳米粒子与胃癌相关分子标志物之间结合力，以及与待测靶分子之间的亲和力，研究可能的影响因素；研究增强制备的探针可溶性与分散性问题，研究不同PH值的胃酸条件下胃癌分子探针的稳定性条件及可能影响因素，研究胃癌探针的靶向性与可能途径；研究胃癌纳米探针的选择性与特异性的条件。（2） 增强胃癌标志物检测的敏感度与特异性的纳米技术纳米粒子对胃癌PCR的灵敏度与特异性影响 纳米粒子对胃癌血清抗原抗体结合的免疫反应的灵敏度与特异性影响碳纳米管与量子点自组装基础上的超敏感检测胃癌相关标志物的原理、技术与方法基于金纳米粒子淬灭荧光分子的信号与待测抗原的浓度对数成线性关系，来建立URG4,BRCAA1,IPO-38，Ndr2等做为预警胃癌标志物的超敏感检测方法，并通过对大样本的统计学分析，确立早期癌的预警值，从而更好的利用URG4、BRCAA1抗原的胃癌预警作用，识别、区分早期癌和高危、低危癌前期病变，为临床提供客观、有力的诊断依据。研究纳米粒子探针对活检组织检测与免疫组化结果的影响。（3） 胃癌分子探针在体定位定量可视化 建立胃癌动物模型，进行下列研究：（1）充分利用3.0T MRI的优势，合理使用快速T1 /T2 /T2*加权、并行采集和动物表面线圈技术，设计开发自动或半自动图象分析软件，获得高信号-噪声比、高的空间和时间分辨率的图像，并对信号改变做定量或半定量的分析。（2）用拉曼光谱仪和IVIS荧光成像系统观察纳米探针进入动物体内后的分布、聚集、消除过程，获取动态图像。（3）利用内窥镜共聚焦成像系统获取纳米探针在胃癌组织中的分布图像。（4）利用超声成像获取纳米探针在胃癌组织中的图像。 在多模态成像系统下，胃癌纳米探针在胃癌组织中成像理论与建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌纳米探针对其标记，研究不同的光、声作用诱导产生的光（波长、振幅、偏振、荧光寿命、非线性效应）和声信号的改变，探寻所产生的信号与肿瘤细胞之间的对应关系。（2）考虑到癌细胞在多层胃组织的侵及程度，构建典型的胃癌模型，其中癌变部分用胃癌分子探针来标记，以此来模拟在体胃癌的情况。（3）利用多种模式包括拉曼光谱仪、超声成像等分子成像技术对模型动物组织样品开展成像检测。考察所得到的信号与单纯胃癌模型所得信号的异同，探讨复杂生物组织结构和边界对分子成像性能的影响；建立不同光、声信号在组织中的迁移-激发-发射-迁移的理论模型。 胃癌分子的在体定位、定量及可视化：根据具有荧光磁性特征的胃癌纳米探针，通过MRI技术对胃癌早期发生的部位进行宏观成像与预警，并在MRI影像引导下，通过光学内窥镜技术对胃部早期病变部位通过诱发荧光进行精确的局部定位，达到胃癌的早期预警。利用多种模式包括拉曼光谱仪、超声成像等分子成像技术对模型动物组织样品开展成像检测，获取胃癌分子探针的信号强度分布，建立鲁棒有效的三维算法，对胃组织内部胃癌早期预警部位进行实时图像标记，结合内窥镜所获得的二维光学荧光信号与MRI三维信号，进行胃癌病变部位信号强度分布的定位定量分析，实现多模态二维（光学荧光信号、超声）、三维（MRI信号）的可视化。（4） 纳米粒子和纳米探针的体内外生物学行为和安全性研究 纳米粒子的细胞安全性研究巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等免疫细胞对不同纳米颗粒的反应、作用过程和机制，揭示纳米颗粒对抗原呈递的作用，对树突状细胞成熟，对免疫细胞趋化运动，对ThlTh2细胞平衡和CD4CD25Tr细胞（regulator T，Tr）功能的影响；研究不同纳米颗粒以及不同纳米特性（如不同尺寸）对转录因子（NF-kB等）、细胞因子和趋化因子（如白介素-1、肿瘤坏死因子）以及炎症反应相关酶等的影响；揭示纳米颗粒诱发特殊免疫反应的机制。 胃癌纳米探针的组织安全性（器官特殊免疫反应）拟通过病理观察研究纳米颗粒所引发的可能炎症反应、刺激性或过敏反应，利用免疫组化、蛋白质组学等方法研究与炎症相关蛋白表达谱的变化，归纳和总结纳米颗粒诱发特殊炎症反应，引发特殊免疫应答的特点与规律。 胃癌纳米探针动物体内的药代动力学和组织分布研究 采用模型动物（小鼠、大鼠）和体外模拟相结合，研究胃癌纳米探针在动物体内可能环境中的动力学行为，重点考察纳米探针的特殊性质对其在体内的分布特性及药代动力学特征的影响，评价胃癌分子探针在不同体内环境中的导向效果。建立纳米材料及其胃癌纳米探针生物效应的数值分析方法，构建特定纳米材料安全性评价的半经验模型。 胃癌纳米探针活体安全性的系统研究 研究胃癌纳米探针在正常动物体内的的急性毒性、长期毒性、特殊毒性及一般药理包括对神经系统、心血管系统、呼吸系统的影响及量效关系，评价包括胃癌分子标志物、纳米粒子、胃癌纳米探针对生物体的安全程度和进一步作为纳米探针开发的可能性。（a）纳米材料本身粒度与动物毒性的关系，在纳米材料的粒度均一性和稳定性前提下，测定纳米物质的急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性；（b）纳米探针、纳米材料对人正常胃粘膜细胞与胃癌细胞的影响及分子机理；（c）纳米材料经不同途径进入动物体内吸收、分布、生物转化以及在不同脏器组织中的沉积和排泄、到达靶点并在靶点聚集的过程；（d）纳米颗粒对于心血管系统的影响及其与血液系统中细胞成分的相互作用；（e）纳米颗粒对于免疫系统、神经系统的影响；（f）纳米物质对亚细胞结构和生物大分子活性的干扰。测定纳米材料对于细胞线粒体、内质网、溶酶体、高尔基体和细胞核等亚细胞结构的影响，对于细胞膜的立体结构的影响以及对于酶等生物大分子的活性影响。根据研究结果，对纳米粒子、纳米探针进行评价，确定胃癌纳米探针用于胃癌预警与分子影像诊断的安全有效的方案，解决它们的稳定性与生物兼容性问题，并提出安全性评价标准。二、预期目标1、总体目标本项目从我国发展纳米生物学和纳米医学的需求出发，应用纳米技术研究胃癌早期诊断与预警系统所涉及的基本科学问题，以增强胃癌分子检测的灵敏度与特异性以及胃癌分子在胃局部组织定位定性定量可视化为主要研究内容，探索纳米材料的生物安全性、靶标导向性，为推进我国纳米生物学和纳米医学的快速发展、提高我国在这一前沿领域的竞争力提供技术保障。通过项目的组织实施，促进纳米技术、肿瘤诊断学、分子生物学、药物化学、药理学等学科的交叉与融合，培养一批能够进行创新性研究的交叉学科人才。项目的完成将有望为胃癌预警系统这一具有挑战性的科学前沿问题提供关键理论与技术支撑。2、五年预期目标1 筛选出3-5种生物相容性好、相对特异、高生物活性的胃癌分子探针，建立灵敏度高与特异性强的纳米技术和方法；建立高效胃癌分子成像的纳米技术和新方法；2 完成2-3种具有自主知识产权的胃癌标志物超敏感检测的纳米技术方法系统研究，为临床应用奠定基础；3 完成1-2种具有自主知识产权的胃癌纳米探针的系统的分子影像研究，为开发胃癌分子影像探针的临床前研究奠定基础；4 建立纳米粒子与胃癌纳米探针的安全性评价体系；5 促进我国材料学、生物医学、药物化学、药理毒理学等学科与纳米医学的交叉融合，在胃癌预警的国际前沿领域取得重大创新成果；在本项目结束时，至少获得一项能应用到临床的研究成果；6 培养一支高水平的研究团队，尤其是培养一批在交叉学科领域具有综合知识和研究能力的人才，通过项目协作组合形成一支在相关领域有影响的学术梯队；培养学科带头人4-6名，硕士研究生50名以上，博士研究生2530名，博士后810名；7 取得本领域具有国际影响力的重要基础研究成果，在国际一流刊物上(包括Nature系列杂志) 发表一批高水平的学术论文, 申请810项专利，发表100篇以上高质量SCI学术论文。三、研究方案总体研究方案1学术思路纳米生物学领域取得的进展为胃癌预警与早期诊断研究提供了新的方法。本申请项目以解决应用纳米技术研究胃癌早期诊断与预警关键科学问题为目标，以研究基于纳米粒子的胃癌早期标志物超敏感特异性检测技术与多模式动态成像技术，以及纳米探针的制造与安全性评价为研究内容，在新一代荧光超顺磁纳米粒子、荧光纳米晶及其复合纳米粒子的制备、性能测试与表征、胃癌早期靶分子特异性分子探针的筛选、靶分子与纳米粒子的复合探针制备、超敏感与特异性的检测方法与多模式成像技术方法、生物兼容性与安全性以及影像学评价，纳米探针等方面做出原创性成果；应用这些理论技术方法，进行源头创新，开发出具有我国自主知识产权和国际先进水平的、超敏感的肿瘤标志物检测方法，安全性好且针对于胃癌的分子显像的纳米探针，为临床应用奠定基础。2技术方案与途径根据上述总体思路，本项目围绕胃癌预警这个长远目标，从纳米材料改善探针理化性质、生物利用度以及作为分子影像探针出发，采用“在细胞水平上观测生物效应，在分子水平上揭示作用机理，在动物模型上验证可行性，总结胃癌纳米探针的特性与胃癌发生发展的规律”的策略，将纳米技术与肿瘤诊断学、药物化学、毒理药理学等学科结合起来，并应用于胃癌预警与早期诊断的研究。项目设置4个课题，项目总体研究方案见图1。图1. 课题总体研究方案具体研究方案和技术路线如下：1胃癌相关分子标志物的筛选与探针设计1.1胃癌相关分子标志物的筛选 采用生物信息学方法从Genebank库中筛选出与胃癌相关基因与蛋白；根据文献，筛选出与胃癌早期状态密切相关的基因与蛋白，设计寡核苷酸片段探针，设计胃癌相关蛋白的抗体Fab片段探针；根据肿瘤血管与缺氧等特征，设计相关抗体Fab片段探针。1.2胃癌相关基因与抗体的探针制备 根据设计的胃癌相关基因探针序列，采用DNA合成仪制备胃癌相关寡核苷酸探针；利用抗体筛选技术平台，制备具有生物活性功能的胃癌相关抗体；采用水解法等技术制备抗体Fab片段；根据肿瘤血管与缺氧靶点，在brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、avb3、HIF等中选择相应的靶点，制备相应抗体Fab片段，最终筛选出合适的探针。2纳米粒子的合成与表征2.1 新型纳米材料的合成与表征a) 荧光磁性纳米粒子的可控合成利用高温溶剂前驱体分解法合成磁性纳米粒子，采用低温法合成量子点，利用等离子镀膜技术，可控地把磁性纳米粒子与量子点组装在一起，然后在表面包裹上二氧化硅，设计实验并制备出不同粒径的荧光磁性纳米粒子，研究温度、溶剂、反应条件等对最终产物的影响，对产物进行表征。b) 树形分子修饰的金纳米棒的合成设计不同长径比的金纳米棒，并可控合成；用第5代树形分子取代金米棒表面的CTAB分子，制备出树形分子修饰的金纳米棒；通过化学反应，使得树形分子表面氨基团变成羧基，显著增强生物相容性。然后进行表征。c) 荧光碳纳米管的合成利用等离子镀膜技术，在碳纳米管表面镀上一层膜，然后与量子点连接，在复合物表面包敷上二氧化硅，并进行表征。d) 包裹ICG的纳米气泡的合成利用MEMS技术可控合成包裹ICG的纳米气泡，利用粒度仪进行表征。也可利用全反射荧光显微镜进行表征。3胃癌纳米探针的制备及其与生物分子相互作用的机理3.1 胃癌纳米探针制备利用羧基与氨基偶联或醛基缩合反应，把制备的纳米粒子与胃癌相关寡核苷酸探针或抗体片段探针结合，制备成胃癌纳米基因探针与胃癌抗体片段探针，研究不同条件下制备的胃癌纳米探针的生物活性并进行表征。3.2 分子水平上将胃癌纳米探针偶联至AFM探针上，利用AFM检测不同种类、不同浓度的样品，通过实时测定胃癌纳米探针与靶基因或靶蛋白分子之间的相互作用力，来揭示制备的胃癌纳米探针的生物活性；利用纳米探针的荧光信号与全反射荧光显微镜，进行直接观察纳米探针与固定的靶基因或靶蛋白之间的相互作用动力学过程，并对测定的信号进行分析。3.2 细胞水平上与靶分子相互作用的研究培养胃癌SGC7901细胞株与胃粘膜GES-1细胞株，分别加入不同浓度、不同种类的胃癌纳米基因探针或胃癌抗体探针作为测试组，实验同时设立细胞对照组及基因及抗体对照组，纳米粒子对照组。利用全反射荧光显微镜，采集相互作用动态图像，然后分析，揭示在不同条件下胃癌纳米探针与靶分子相互作用的机理。4纳米粒子对PCR灵敏度与特异性的影响4.1 荧光磁性纳米粒子对PCR的影响以我们报道的检测胃癌相关基因表达水平的多重PCR为模型，调查修饰与未修饰的荧光磁性纳米粒子在胃癌PCR过程中，荧光信号的变化规律，发展定量PCR新原理；研究荧光磁性纳米粒子对PCR特异性的影响规律，为消除胃癌PCR检测的假阳性结果提供理论依据。4.2 树形分子修饰的金纳米棒对PCR的影响以我们报道的检测胃癌相关基因表达水平的多重PCR为模型，调查树形分子修饰的金纳米棒对胃癌PCR的灵敏度与特异性的影响，测定在PCR过程中拉曼光谱变化的规律，阐明其增强PCR效率的机理。4.3 荧光碳纳米管对PCR的影响我们报道过碳纳米管增强PCR效率，此研究中，深入研究荧光碳纳米管在胃癌PCR检测过程中荧光信号强度变化的规律，对灵敏度与特异性的影响机理。5纳米粒子对免疫反应的灵敏度与特异性的影响我们首次报道了金纳米粒子荧光淬灭现象基础上的超敏感抗原定量检测原理与方法。其原理是：一种抗体修饰磁性纳米粒子，另一种抗体修饰纳米金粒子，当抗原存在时，抗原抗体反应，形成夹心结构，离心去除夹心复合物，上清中残余的纳米金粒子，可以淬灭FITC荧光分子信号，在516nm处的荧光淬灭强度与抗原量呈正比。此技术获得了专利授权（ZL200310109350.3）。我们利用胃癌相关抗原BRCAA1（AF208045）作为检测的靶分子，利用2个单克隆抗体分别标记荧光磁性纳米粒子与金纳米粒子（或金纳米棒），研究在免疫反应前后，荧光信号强度变化，是否具有规律性，力求发展新的灵敏特异的检测原理与方法。6 胃癌相关分子在体定位定量可视化研究6.1 建立胃癌动物模型，进行下列研究：（1）充分利用3.0T MRI的优势，合理使用快速T1 /T2 /T2*加权、并行采集和动物表面线圈技术，设计开发自动或半自动图象分析软件，获得高信号-噪声比、高的空间和时间分辨率的图像，并对信号改变做定量或半定量的分析。（2）用拉曼光谱仪和IVIS荧光成像系统观察纳米探针进入动物体内后的分布、聚集、消除过程，获取动态图像。（3）利用内窥镜共聚焦成像系统获取纳米探针在胃癌组织中的分布图像。（4）利用超声成像获取纳米探针在胃癌组织中的图像。6.2 在多模态成像系统下，胃癌分子探针在胃癌组织中分子成像理论与建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌纳米探针对其标记，研究不同的光、声作用诱导产生的光（波长、振幅、偏振、荧光寿命、非线性效应）和声信号的改变，探寻所产生的信号与肿瘤细胞之间的对应关系。（2）考虑到癌细胞在多层胃组织的侵及程度，构建典型的胃癌模型，其中癌变部分用胃癌纳米探针来标记，以此来模拟在体胃癌的情况。（3）利用多种模式包括拉曼光谱仪、超声成像等分子成像技术对模型动物组织样品开展成像检测。考察所得到的信号与单纯胃癌模型所得信号的异同，探讨复杂生物组织结构和边界对分子成像性能的影响；建立不同光、声信号在组织中的迁移-激发-发射-迁移的理论模型。6.3 胃癌分子的在体定位、定量及可视化：根据具有荧光磁性特征的胃癌纳米探针，通过MRI技术对胃癌早期发生的部位进行宏观成像与预警，并在MRI影像引导下，通过光学内窥镜技术对胃部早期病变部位通过诱发荧光进行精确的局部定位，达到胃癌的早期预警。利用多种模式包括拉曼光谱仪、超声成像等分子成像技术对模型动物组织样品开展成像检测，获取胃癌分子探针的信号强度分布，建立鲁棒有效的三维算法，对胃组织内部胃癌早期预警部位进行实时图像标记，结合内窥镜所获得的二维光学荧光信号与MRI三维信号，进行胃癌病变部位信号强度分布的定位定量分析，实现多模态二维（光学荧光信号、超声）、三维（MRI信号）的可视化。7纳米探针的生物学效应与安全性7.1 纳米探针的药效学和安全性（毒理学）研究采用MTT法研究胃癌纳米探针对胃癌细胞株、正常胃粘膜细胞株的生长抑制作用。结合我们过去已建立的胃黏膜癌变模型，考察纳米探针的体内分布和动力学特征，以国家食品药品监督管理局药物评价指南为基础和指导，参照国际药物检测和评价机构所制定的药理学的评价方法对纳米颗粒的生物学效果和毒性进行系统性评价。4.2胃癌纳米探针跨膜转运机制和细胞器定位特性对纳米探针加入细胞培养基中培养，采用流式细胞仪快速定量地测定细胞内纳米探针的动态变化，研究纳米探针跨膜转运能力和胞内蓄积特性。运用细胞器荧光探针标记技术结合荧光免疫染色技术研究纳米探针在细胞核（Hoechst33342）、溶酶体（LysoTracker Green DND-26）、高尔基体(Brefeldin A)、内质网(DiOC6(3)及线粒体(MitoTracher Green FM)等亚细胞器定位和分布情况。通过抑制与细胞内吞相关蛋白或脂的活性，观察是否与它们介导的纳米探针跨膜转运有关，如抑制脂筏介导的内吞（Cyclodextrin or nystatin）、抑制小窝蛋白介导的内吞（Filipin）、抑制网格蛋白介导的内吞（Chlorpromazine）、抑制肌动蛋白介导的内吞（Cytochalasin D）、抑制细胞粘附分子介导的内吞（amiloride）和抑制微管的活性（Nocodazole）。7.3 纳米探针的细胞内运输机制由选择性抑制剂或利用基因操作技术对与细胞内囊泡生成、转运、融合有关的信号通路进行抑制，确定纳米探针是否存在亚细胞器间的转运。如Brefeldin A抑制囊泡从内质网到高尔基体的转运；Wortmannin 抑制PI3K介导的内涵体与溶酶体的囊泡融合，并运用全反射荧光显微镜、HR-MAS 核磁共振等技术研究活细胞与纳米探针的共存体系以解析纳米探针与生物膜的相互作用及其跨膜转运和胞内运输机制。7.4 纳米粒子及其纳米探针的活体安全性评价采用模型动物（小鼠、大鼠）分别研究纳米粒子与纳米探针在动物体内的组织分布和动力学行为；研究不同体液环境的纳米粒子及其纳米探针在生物体内的代谢动力学；研究在正常动物体内纳米粒子的急性，亚急性及可能的长期毒性、神经系统毒性和免疫原性；研究纳米探针的分子及细胞安全性。为进一步纳米探针的应用奠定安全性评价标准。四、年度计划年度计划内容和目标：第一年度计划内容：1胃癌相关分子标志物的筛选与探针设计胃癌相关分子标志物的筛选 采用生物信息学方法从Genebank库中筛选出与胃癌相关基因与蛋白；根据文献，筛选出与胃癌早期状态密切相关的基因与蛋白，设计寡核苷酸片段探针，设计胃癌相关蛋白的抗体Fab片段探针；根据肿瘤血管与缺氧等特征，设计相关抗体Fab片段探针。部分胃癌相关基因与抗体的探针制备 根据设计的胃癌相关基因探针序列，采用DNA合成仪制备胃癌相关寡核苷酸探针；利用抗体筛选技术平台，制备具有生物活性功能的胃癌相关抗体；采用水解法等技术制备抗体Fab片段；根据肿瘤血管与缺氧靶点，在brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、avb3、HIF等中选择相应的靶点，制备相应抗体Fab片段。2纳米粒子的合成与表征荧光磁性纳米粒子的可控合成利用高温溶剂前驱体分解法合成磁性纳米粒子，采用低温法合成量子点，利用等离子镀膜技术，可控地把磁性纳米粒子与量子点组装在一起，然后在表面包裹上二氧化硅，设计实验并制备出不同粒径的荧光磁性纳米粒子，研究温度、溶剂、反应条件等对最终产物的影响，对产物进行表征。树形分子修饰的金纳米棒的合成设计不同长径比的金纳米棒，并可控合成；用第5代树形分子取代金米棒表面的CTAB分子，制备出树形分子修饰的金纳米棒；通过化学反应，使得树形分子表面氨基团变成羧基，显著增强生物相容性。然后进行表征。荧光碳纳米管的合成利用等离子镀膜技术，在碳纳米管表面镀上一层膜，然后与量子点连接，在复合物表面包敷上二氧化硅，并进行表征。氧化锌纳米材料的合成利用CVD等技术，合成氧化锌纳米材料，并进行表征。3纳米粒子对PCR灵敏度与特异性的影响以我们报道的检测胃癌相关基因表达水平的多重PCR为模型，调查修饰与未修饰的荧光磁性纳米粒子在胃癌PCR过程中，荧光信号的变化规律，发展定量PCR新原理；研究荧光磁性纳米粒子对PCR特异性的影响规律，为消除胃癌PCR检测的假阳性结果提供理论依据；调查树形分子修饰的金纳米棒对胃癌PCR的灵敏度与特异性的影响，测定在PCR过程中拉曼光谱变化的规律，阐明其增强PCR效率的机理；深入研究荧光碳纳米管在胃癌PCR检测过程中荧光信号强度变化的规律，对灵敏度与特异性的影响机理。4建立胃癌动物模型，为活体分子影像研究奠定基础。5对部分纳米材料进行生物学效应与安全性评价采用MTT法研究合成的纳米粒子对胃癌细胞株、正常胃粘膜细胞株的生长抑制作用。结合我们过去已建立的胃黏膜癌变模型，考察纳米探针的体内分布和动力学特征，以国家食品药品监督管理局药物评价指南为基础和指导，参照国际药物检测和评价机构所制定的药理学的评价方法对纳米颗粒的生物学效果和毒性进行系统性评价。目标：制备出高质量的不同粒径的荧光磁性纳米粒子、量子点、金纳米棒等纳米材料；筛选、设计并制备出胃癌相关基因探针与抗体探针，然后与纳米粒子复合，制备成胃癌纳米探针；阐明纳米粒子对胃癌PCR的灵敏度与特异性影响的原理；建立胃癌动物模型，为分子影像研究奠定基础；对部分纳米粒子进行安全性评价研究。第二年度计划内容：1部分胃癌相关基因与抗体的探针制备 根据设计的胃癌相关基因探针序列，采用DNA合成仪制备胃癌相关寡核苷酸探针；利用抗体筛选技术平台，制备具有生物活性功能的胃癌相关抗体；采用水解法等技术制备抗体Fab片段；根据肿瘤血管与缺氧靶点，在brcaa1、ndr2、UAG4、gcys-20、gcys-1、HAI-178、survivin、VEGF、avb3、HIF等中选择相应的靶点，制备相应抗体Fab片段，最终筛选出合适的探针。2纳米粒子对免疫反应的灵敏度与特异性的影响我们首次报道了金纳米粒子荧光淬灭现象基础上的超敏感抗原定量检测原理与方法。其原理是：一种抗体修饰磁性纳米粒子，另一种抗体修饰纳米金粒子，当抗原存在时，抗原抗体反应，形成夹心结构，离心去除夹心复合物，上清中残余的纳米金粒子，可以淬灭FITC荧光分子信号，在516nm处的荧光淬灭强度与抗原量呈正比。此技术获得了专利授权（ZL200310109350.3）。我们利用胃癌相关抗原BRCAA1（AF208045）作为检测的靶分子，利用2个单克隆抗体分别标记荧光磁性纳米粒子与金纳米粒子（或金纳米棒），研究在免疫反应前后，荧光信号强度变化，是否具有规律性，力求发展新的灵敏特异的检测原理与方法。3MRI等多模式分子影像研究充分利用3.0T MRI的优势，合理使用快速T1 /T2 /T2*加权、并行采集和动物表面线圈技术，设计开发自动或半自动图象分析软件，获得高信号-噪声比、高的空间和时间分辨率的图像，并对信号改变做定量或半定量的分析。用拉曼光谱仪和IVIS荧光成像系统观察纳米探针进入动物体内后的分布、聚集、消除过程，获取动态图像。利用内窥镜共聚焦成像系统获取纳米探针在胃癌组织中的分布图像。利用超声成像获取纳米探针在胃癌组织中的图像。4. 胃癌纳米探针跨膜转运机制和细胞器定位特性对纳米探针加入细胞培养基中培养，采用流式细胞仪快速定量地测定细胞内纳米探针的动态变化，研究纳米探针跨膜转运能力和胞内蓄积特性。运用细胞器荧光探针标记技术结合荧光免疫染色技术研究纳米探针在细胞核（Hoechst33342）、溶酶体（LysoTracker Green DND-26）、高尔基体(Brefeldin A)、内质网(DiOC6(3)及线粒体(MitoTracher Green FM)等亚细胞器定位和分布情况。通过抑制与细胞内吞相关蛋白或脂的活性，观察是否与它们介导的纳米探针跨膜转运有关，如抑制脂筏介导的内吞（Cyclodextrin or nystatin）、抑制小窝蛋白介导的内吞（Filipin）、抑制网格蛋白介导的内吞（Chlorpromazine）、抑制肌动蛋白介导的内吞（Cytochalasin D）、抑制细胞粘附分子介导的内吞（amiloride）和抑制微管的活性（Nocodazole）。目标：筛选、设计并制备出胃癌相关基因探针与抗体探针，然后与纳米粒子复合，制备成胃癌纳米探针；揭示纳米粒子对胃癌血清抗原抗体结合的免疫反应的灵敏度与特异性影响的机理；获取基于荧光磁性纳米粒子、金纳米棒等基础上的MRI、超声成像、表面增强拉曼、IVIS荧光成像、内窥镜下激光共聚焦分子成像的信号强度分布资料；研究纳米探针跨膜转运能力和胞内蓄积特性。第三年研究内容：1胃癌纳米探针与生物分子相互作用的机理分子水平上与生物分子相互作用将胃癌纳米探针偶联至AFM探针上，利用AFM检测不同种类、不同浓度的样品，通过实时测定胃癌纳米探针与靶基因或靶蛋白分子之间的相互作用力，来揭示制备的胃癌纳米探针的生物活性；利用纳米探针的荧光信号与全反射荧光显微镜，进行直接观察纳米探针与固定的靶基因或靶蛋白之间的相互作用动力学过程，并对测定的信号进行分析。细胞水平上与靶分子相互作用的研究培养胃癌SGC7901细胞株与胃粘膜GES-1细胞株，分别加入不同浓度、不同种类的胃癌纳米基因探针或胃癌抗体探针作为测试组，实验同时设立细胞对照组及基因及抗体对照组，纳米粒子对照组。利用全反射荧光显微镜，采集相互作用动态图像，然后分析，揭示在不同条件下胃癌纳米探针与靶分子相互作用的机理。2系统研究碳纳米管与量子点自组装基础上的超敏感检测胃癌相关标志物的原理、技术与方法；3 在多模态成像系统下，胃癌分子探针在胃癌组织中分子成像理论与建模：（1）建立胃癌模型，采用胃癌纳米探针对其标记，研究不同的光、声作用诱导产生的光（波长、振幅、偏振、荧光寿命、非线性效应）和声信号的改变，探寻所产生的信号与肿瘤细胞之间的对应关系。（2）考虑到癌细胞在多层胃组织的侵及程度，构建典型的胃癌模型，其中癌变部分用胃癌纳米探针来标记，以此来模拟在体胃癌的情况。（3）利用多种模式包括拉曼光谱仪、超声成像等分子成像技术对模型动物组织样品开展成像检测。考察所得到的信号与单纯胃癌模型所得信号的异同，探讨复杂生物组织结构和边界对分子成像性能的影响；建立不同光、声信号在组织中的迁移-激发-发射-迁移的理论模型。4 纳米粒子及其纳米探针的活体安全性评价采用模型动物（小鼠、大鼠）分别研究纳米粒子与纳米探针在动物体内的组织分布和动力学行为；研究不同体液环境的纳米粒子及其纳米探针在生物体内的代谢动力学；研究在正常动物体内纳米粒子的急性，亚急性及可能的长期毒性、神经系统毒性和免疫原性；研究纳米探针的分子及细胞安全性。为进一步纳米探针的应用奠定安全性评价标准。目标：研究制备的纳米探针的生物活性并进行表征；研究胃癌相关基因探针与纳米材料之间的相互作用；系统研究碳纳米管与量子点自组装基础上的超敏感检测胃癌相关标志物的原理、技术与方法；实现各种成像模式相互补充，最后获取完整的胃癌病理生理信息；对纳米材料、纳米探针在体内的吸收、分布、代谢过程，以及对细胞、组织、器官、神经系统及遗传物质的影响进行评估。第四年研究内容：1研究纳米探针与纳米材料之间相互作用的机理，提出纳米材料对胃癌分子探针生物活性影响的理论模型；2研究基于金纳米粒子淬灭荧光分子的信号与待测抗原的浓度对数成线性关系，来建立URG4,BR