吡喹酮皮下植入剂的体内释放考察及组织相容性研究.doc

吡喹酮皮下植入剂的体内释放考察及组织相容性研究程亮，郭圣荣*上海交通大学药学院 上海 200240摘要：目的 制备了一种以PEG、PCL为基质的吡喹酮皮下植入剂并对其进行动物体内释放考察及组织相容性研究。方法 通过热熔融挤出法制备了吡喹酮皮下植入剂；采用HPLC法测定了皮下给药后，吡喹酮在动物体内的血药浓度；采用HE染色法观察了皮下植入部位组织的炎症反应。结果 药物能够维持较高的血药浓度（300 ng/ml）达6 周以上；皮下组织在经历了急性的炎症反应期后，炎症反应逐渐消失，组织得以完全愈合。结论 吡喹酮皮下植入剂一次给药后，可以缓慢有效释放长达42 d以上，同时制剂具有很好的组织相容性。关键词：植入剂 吡喹酮 体内释放 生物相容性中图分类号： 文献标识码： 文章编号：In vivo drug release and tissue biocompatibility investigation on Praziquantel-contained subcutaneous implantsCheng Liang, Guo Sheng-rong*Pharmacy school of shanghai jiaotong university, Shanghai 200240Abstract: OBJECTIVE To prepare praziquantel-contained implants and to investigate the in vivo drug release in rats and the tissue biocompatibility. METHODS The praziquantel-contained implants were fabricated by hot-melting extrusion; the plasma drug concentration was determined by HPLC; the tissue biocompatibility was studied by HE method. RESULTS The plasma drug concentration was maintained above 300 ng/ml with a duration over 42 d; after a acute inflammation, the subcutaneous tissue was healed gradually. CONCLUSION The implants were proved to maintain effective plasma concentration up to 42 d and be biocompatible after implantation.Key Words: implants; praziquantel; in vivo drug release; biocompatibility包虫病（Hydatid disease）又称为棘球蚴病，是由棘球属绦虫引起的人畜共患寄生虫病。我国包虫病的分布主要在西北省份的畜牧区，调查显示在上述地区此病的发病率约为111。目前，包虫病的治疗手段为手术治疗和化学治疗：手术治疗的成本及危险性较高，同时该方法对医疗条件的要求也较高，故在西北牧区难以普及；化学治疗具有给药方便、成本低廉、安全有效等优点，故为我国治疗包虫病的首选方案。但是，传统的给药方式，即口服给药，依旧存在几点不足：.药物的水溶性较差，口服药物后，部分药物因不能完全溶解而无法吸收；.由于肝首过效应，经肠道吸收的药物，大部分被代谢成无药理活性的产物，致使药物的利用率较低；.根据该病的严重程度，口服药物的治疗疗程通常为1月到数月不等，频繁地口服药物给病人带来了许多痛苦，另外，较高的口服剂量极易产生耐药性2,3。皮下给药系统（subcutaneous drug delivery systems）是近年来制剂研究的热点，药物通过皮下给药不仅可以有效避免肝的首过效应，而且还可以极大程度地提高药物的生物利用度，减少给药的次数4。在以前的工作中，我们采用加热熔融挤出法制备了一种以聚己内酯、聚乙二醇1500为混合基质的吡喹酮植入剂，体外释放表明，药物可以缓慢释放长达60天。本实验的目的是考察该植入剂植入到动物皮下的药物动力学，并对制剂的组织相容性进行了考察。1 仪器与材料1.1 仪器高效液相色谱仪（Shimadzu LC-10AD泵，Shimadzu SPD-10ADvp紫外检测器，Shimadzu柱温箱），Dikma C18 色谱分离柱（4.6250 mm，粒径5 um）TGL-16G型高速离心机（上海安亭科学仪器厂），QL-901型旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂），场发射扫描电子显微镜（FSEM，JEOL-7401F，日本JEOL公司）。1.2 材料吡喹酮（纯度99，上海嘉辰化工有限公司），聚己内酯（重均分子量为50000，日本大赛璐有限公司），聚乙二醇1500（国药集团化学试剂有限公司），甲醇（色谱级，上海星可生化有限公司），地西冸标准品（中国生物制品检验所），其余试剂均为分析级。SD大鼠，雄性，24只（上海斯莱特动物饲养中心）2 实验方法2.1植入剂的制备按一定重量百分比(PZQ:PCL:PEG=50:30:20,w/w)称取PZQ、PCL、PEG, 置于研钵中, 混合 30 min 后, 将其投入到双轴螺旋流变仪中, 加热至熔融, 并继续搅拌20min, 加热温度为70 , 搅拌速度为45rpm. 待熔融物固化后, 将得到的固体分散体粉碎, 并填充于自制的注射器中, 于70 条件下将熔融的固体分散体挤入到内径为3mm 的圆柱状模具中, 室温冷却固化后, 脱模, 并将所得圆棒截成长度为20mm的圆柱状植入剂。2.2 植入剂的体外释放考察3 个植入剂样品被用于体外释放研究，植入剂称重后分别置入具塞的玻璃瓶中，每瓶中加入30ml 0.2% SDS-水溶液释放介质。释放考察在摇床中进行，水浴温度为37，振摇速率为50 rpm。在预定的时间点，5 ml 释放介质被吸取用于药物浓度分析，同时更换新鲜的释放介质，整个释放过程均保持在漏槽条件。2.3 血药分析方法的建立2.3.1 色谱条件色谱柱：Dikma C18柱（4.6250 mm，5 um）；流动相：甲醇-水（100:40）；流速：1.0 mlmin-1；柱温：30；检测波长：217 nm。2.3.2 血样处理在预定的时间点，通过眼眶采取 2 ml 血，3000 rpm离心15 min分离血浆，吸取1 ml血浆置入15 ml具塞PE离心管中，加入地西冸内标溶液100 ul后，加入1 ml饱和硫酸铵水溶液，涡旋1 min后，加入二氯甲烷-甲基叔丁基醚混合溶剂再次涡旋20 min，10000 rpm离心5 min后，吸取上层有机层，氮气吹干有机溶剂后，残留物用200 ul 流动相定容，10000 rpm 离心5 min 后，吸取50 ul 上清液进HPLC 分析药物浓度。2.3.3 测定方法的特异性按2.3.2方法处理空白血浆样品、加药血浆样品，进HPLC分析，色谱图如，由图可见，血浆中的成分对药物的测定不产生干扰。2.3.4 测定方法的工作曲线配制1 mg/ml 的PZQ母液，用甲醇稀释至不同浓度0.5 ug/ml，1 ug/ml，2 g/ml，4 ug/ml，8 ug/ml， 16 ug/ml的工作溶液，取6份1 ml的空白血浆样品，每份血浆中加入100 ul不同浓度的工作溶液，按2.3.2方法处理，进HPLC分析，得到工作曲线为y0.0008x0.1946（r0.9973），最低定量限为50 ng/ml。2.3.5 测定方法回收率实验取低、中、高3个质量浓度的血浆样品，按2.3.2方法处理并进HPLC分析，记录下峰面积，记作As；进同等浓度的纯PZQ甲醇溶液进行分析，记录下峰面积，记作Ar，药物的回收率按以下公式计算：回收率As/Ar100。结果，低、中、高3个质量浓度的平均回收率分别为（98.95.8）, （91.01.5）, （96.02.6）（n5），均符合要求。2.3.6 测定方法精密度实验取低、中、高3个质量浓度的血浆样品各5份，按2.3.2方法处理并进HPLC分析，记录药物峰面积，并计算日间、日内精密度，得到的日内精密度分别为：5.82，1.72，2.75；日间精密度分别为：15.0，13.1，3.8。均符合要求。2.4 植入剂的体内释放考察24 只雄性SD 大鼠用于植入剂的体内释放考察，在皮下植入制剂前，24 只大鼠分成6 组。皮下植入过程如下：大鼠经腹腔注射1 ml 20% 乌拉坦水溶液后，固定在手术台上，随后在背部剪开3 个1 cm 的左右的口子，分别植入3 根植入剂，最后用手术缝线将伤口缝合，为了避免植入剂粘合在一起影响药物的释放，3 个开口的间距保持在1.5 cm 左右。植入剂植入大鼠皮下后， 于预定的时间点，经大鼠眼眶采血2 ml，按2.3.2方法处理并进HPLC分析血浆药物浓度。2.5 植入剂中残余药量的考察植入剂体内释放考察过程中，在预定的时间点，宰杀一批大鼠，将植入剂取出，清除黏附的组织并冷冻干燥，干燥后的制剂溶解于5 ml 乙腈中，加入20 ml 甲醇沉淀PCL后，10000 rpm 离心15 min，吸取上清液进HPLC分析，并计算制剂中药物的累积释放百分量。2.6 植入剂的体内体外相关性考察将药物的体外释放累积百分率对药物的体内释放累积百分率进行线性拟合，得到药物的体内体外相关方程。2.7 植入剂的SEM 考察植入剂体外释放前、后的表面及截面，不同时刻点的体内释放表面及截面形貌用扫描电子显微镜（SEM）观察。在观察前，所用的样品真空干燥48 h 并进行表面喷金处理。2.8 植入剂组织相容性考察在不同的时间点处死动物，取出植入部位的皮下组织，经过HE染色后，进行组织病理观察。3 实验结果与讨论3.1 植入剂的制备通过加热熔融挤出法制备的植入剂，具有光滑致密的外观（图1），表明在制备过程中，粉碎的固体分散体颗粒得到了较好的固化愈合，同时用HPLC法测得植入剂实际载药量为50.3%1.6，较小的SD值表明本实验采用的制备方法具有很好的重现性。另外，在进行药物含量分析的时候，色谱图中也未出现任何杂峰，表明在热处理的过程中，药物具有很好的热稳定性。图1 植入剂的数码照片Fig1 Macroscopic image of implant.3.2 植入剂的体外释放考察植入剂的体外释放（见图2）可以分为两相：起始的快速释放相及随后的缓慢释放相。植入剂在起始的24 h 内共释放了大约14.8% 的药物，在接下的1400 h 内大约98.4% 的药物得以释放。用Ritger-Peppas 方程对释放曲线进行拟合，得方程Wt=1.53t0.7045，Wt代表Mt/M，r0.9990，表明药物的释放机制为扩散与溶蚀的结合。图2 植入剂的体外释放曲线Fig2 In vitro release curve of implant.3.3 大鼠血浆中药物浓度考察血浆中药物浓度-时间曲线如图3 所示, 在 42 天的考察期内，药物的血浆浓度水平一直维持在100 ng/ml 以上，最大的血浆药物浓度出现在第7 天，达到670 ng/ml , 表明药物的释放吸收与代谢排泄达到平衡，之后药物的血浆浓度逐渐降低，直至考察结束，药物的血浆浓度降低至300 ng/ml 左右。据文献报道5，血浆中药物浓度达到70 ng/ml 即可对包虫虫体产生杀灭作用，本实验中所测血浆药物浓度均远远高于这一值，表明本研究制备的植入剂可以长期、有效的释放药物。图3 PZQ的血浆浓度曲线（n4）Fig3 Plasma concentration curve of PZQ (n=4).3.4 植入剂中残余药量的考察植入剂在体内的药物累积释放曲线如图4所示，与体外释放曲线相似，植入剂在体内的释放过程也可以分为两相：起始的快速释放相及随后的缓慢释放相。第7 天累积释放药物约23.3%， 第42 天累积释放了约80% 的药物。对体内及体外的释放数据进行线性拟合，得线性方程y=1.3807x-53.11，r=0.9725(见图5)，由拟合曲线可知，植入剂在体内的释放较体外稍慢。图4 PZQ从植入剂中的累积释放百分数曲线Fig4 Cumulative release of PZQ from implants implanted into the rats.图5 体内外相关性曲线Fig5 In vivo-in vitro correlation curve.3.5 植入剂体内释放前后形貌考察图6（a, b）显示植入剂具有密实的表面及截面形貌，进一步证实了植入剂在冷却过程中有着较好的愈合。图6（c, d）显示体外释放后，植入剂的表面及截面形成了许多孔洞，这些孔洞相互连接并贯穿，从而有效地缩短了药物扩散的路径，加快了药物的释放速率。植入剂植入体内后，一周与六周后的表面形貌与体外释放的表面形貌几乎一致，许多有一定规则形状的孔洞被观察到，这些孔洞极可能是药物释放以后形成的。一周与六周的截面形貌有较大差别，从第一周的截面图可见，有许多药物的晶体分散在PCL基质中，同时产生少量的孔隙，第六周的截面难以观察到药物的晶体，仅可见许多药物释放后留下的有规则形状的孔隙，这与植入剂的体内释放曲线数据一致。(a)(b) (d) (e)(f) (h)(g) (i)图6 植入剂及原料药的扫描电镜照片：（a-d）植入剂释放前后的表面及截面形貌；（e-h）不同时间点从大鼠皮下取出的植入剂的表面及截面形貌，（e，f）第一周；（g, h) 第六周；(i) 原料药的照片Fig6 Scanning electron microscopic images of implant and pure PZQ respectively: (a-d) surface and cross-sectional morphology of implant before and after in vitro release; (e-h) surface and cross-sectional structure of implant retrieved from subcutaneous tissue of rats at different time point, (e, f) the first week; (g, h) the sixth week; (i) image of pure PZQ.3.6 植入剂组织相容性考察大鼠皮下组织的病理切片见图7。由图7a可见，正常的大鼠皮下组织中存在少量的淋巴细胞；由图7b可见，28 d后在植入部位浸润了大量的淋巴细胞及血红细胞，这可能是在手术植入植入剂的过程中，对皮下组织造成的损伤而引发的急性创伤性炎症反应；由图7c可见，42 d后植入部位的炎症反应明显减弱，淋巴细胞及血红细胞数目显著减少，周围组织出现玻璃化样变，标志组织的创伤愈合接近完成，同时也表明植入剂具有良好的生物相容性。(a)(b)(c)图7 不同时间点从大鼠皮下植入部位取出的组织的病理切片照片：a. 正常皮下组织 b. 28天后的皮下组织 c. 42天后的皮下组织Fig7 The pathology slices of subcutaneous tissue retrieved from the implantation site at different time intervals: a. normal subcutaneous tissue b. subcutaneous tissue after 28 d c. subcutaneous tissue after 42 d4 结论本研究采用加热熔融挤出法制备了一种以PEG、PCL为基质的PZQ缓释植入剂，体外实验表明药物能够缓慢释放大约两个月，体内实验进一步表明该植入剂能够持续、有效地释放药物长达 6 周以上，基本达到了治疗包虫病的给药要求，同时该植入剂具有良好的生物相容性。5 致谢本