《动物生物化学实验技术》葡聚糖凝胶层析技术.ppt

葡聚糖凝胶SephadexG 25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结 引言层析法也称色谱法 是1906年俄国植物学家Michael等发现并命名的 他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子 各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开 由此得名为 色谱法 Chromatography 后来无色物质也可利用吸附柱层析分离 1944年出现纸层析 以后层析法不断发展 相继出现气相层析 高压液相层析 薄层层析 亲和层析 凝胶层析等 层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异 如吸附力 分子形状及大小 分子亲和力 分配系数等 使各组分在两相 一相为固定的 称为固定相 另一相流过固定相 称为流动相 体系中的分布程度不同 从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的 如盐析 粗分级分离 向蛋白质溶液中加入大量的中性盐 NH4 2SO4 Na2SO4 Na2SO4 使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 这种现象称为盐析 凡盐析所获得的粗制蛋白质 如盐析得到的IgG 中均含有硫酸铵等盐类 将影响以后的纯化 所以纯化前均应除去 此过程称为 脱盐 desalthing 脱盐常用透析法和凝胶过滤法 大分子保持天然构象状态 功能有关 有高度的生物活性 常用的柱层析方法有葡聚糖凝胶柱层析 分子筛层析 离子交换层析 吸附层析 亲和层析等 一 实验目的 1 掌握葡聚糖凝胶柱层析法脱盐分离蛋白质的原理 2 学会葡聚糖凝胶柱层析法脱盐和分离蛋白质实验操作技术 凝胶过滤层析技术 二 基本原理当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时 根据它们分子大小不同而进行分离的技术 凝胶层析 gelchromatography 又称为凝胶过滤 gelfiltration 分子筛过滤 molecularsievefiltration 等 它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术 其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相 凝胶 具有分子筛的特点 将被分离物质各成分按分子大小分开 达到分离的方法 凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构 网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态 人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼 小于筛眼的物质分子均可通过 大于筛眼的物质分子则不能 故称为 分子筛 小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼 并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动 从一个颗粒的网眼流出 又进入另一颗粒的网眼 如此连续下去 直到流过整个凝胶 柱为止 因而流程长 阻力大 流速慢 大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼 只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动 其流程短 阻力小 流速快 比小分子先流出层析柱 小分子最后流出 分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子 则居中流出 这样被分离物质即被按分子的大小分开 完全排阻 完全渗入 居中流出 这是由葡萄糖的多聚物与1 氯 2 3 环氧丙烷交连而成 环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来 凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例 交联度 来控制 交联葡聚糖凝胶 商品名为Sephadex 常以G 10至G 200号码标记G 反应凝胶的交联程度 膨胀程度等G后面的数字是其吸水量 毫升水 克干胶 乘以10所得的值 如G 25即表示吸水量为2 5ml 1g干胶 市售有G 10 G 25 G 50 G 75 G 100 G 150 G 200等型号 G 75以上的胶因吸水量大 膨胀后形态柔软易变 统称为软胶 G 75以下的称为硬胶 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万 一般说SephadexG l0 15通常用于分离肽及 脱盐 SephadexG 75 200用以分离各类蛋白质 凝胶层析是一种物理分离法 葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性 不与被分离物质发生反应 所以分离的效果较好 三 操作1 凝胶溶胀 凝胶的用前处理 商品葡聚糖凝胶为干燥颗粒 使用前必须水化溶胀 凝胶溶胀有两种方法 一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀 另一种是置于沸水浴中溶胀 各种葡聚糖凝胶在上述溶胀方法中所需的时间见下表 目前多用 热法 溶涨 这样可大大加速溶涨平衡 通常1 2h即可完成 热法 溶涨还可以消毒 杀灭凝胶中污染的细菌 同时也排除了凝胶内的汽泡 可见 不同类型的各种凝胶溶涨所需的最少时间是不相同的 请参考有关的技术数据 在凝胶溶涨的处理过程中 不能进行剧烈搅拌 禁止使用电磁搅拌器 以为这样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片 2 装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法 作层析用的柱子称层析柱 柱子的一端为进口 另一端为出口 出口端底部有烧结玻璃砂板 能阻止层析剂流出 溶剂则可流过 层析柱的长短粗细根据实验的目的而定 一般说来 凝胶层析时柱越长 分离效果越好 但柱过长 层析时间长 样品易稀释造成扩散 装柱是凝胶层析中一个关键的操作步骤 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度 不能时断时续 否则将出现分层或 纹路 等毛病 若在灌好胶后才发现 纹路 分层等现象时 要重新装柱 以免影响层析效果 在做大型的凝胶柱时 灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来 所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞 色素C 血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖 2000 Bluedextran 2000 通过凝胶柱 观察形成的色斑带是否整齐 若斑带歪斜 应该重新装柱 直至达到要求 3 平衡装好的凝胶柱 使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液流过凝胶柱 以压实凝胶 称为平衡 4 上样将样品加入到凝胶柱中 准备层析的过程称上样 注意上样量的多少 样品的黏稠度等因素 脱盐 层析时 上样体积可为柱体积的10 25 生物大分子的分级分离 约为柱体积的1 5 样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上 否则洗脱峰会变宽和歪斜 上样操作 放出凝胶柱面上的溶液 但切忌液面低于凝胶表面 然后将样品加在凝胶表面 打开柱下口开关 使样品慢慢渗入凝胶内 加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面 也不能沿管壁流下 当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时 关闭下口 完成上样 然后在凝胶柱面上加一层 3 5cm 洗脱液 接上洗脱瓶准备洗脱 5 洗脱用规定的溶液流过样品 使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱 洗脱液放在贮液瓶 洗脱瓶 中并与层析柱相通 打开层析柱下口开关 洗脱液即可流出 洗脱过程要保持适当的恒定流速 流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出 过慢时已分离的分子会因扩散而混合 洗脱液的流速取决于它的静水压 静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力 或接触空气的两个液面间的高差 这个高度差越大 静水压越大 洗脱液的流速就越快 这个压力差可以调动 如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减 因此静水压又称操作压 在凝胶层析中 不仅要保持静水压的恒定 还要保持适当的静水压 这是因为G 75以上的软胶胶体柔软易变形 最初流速会很快 其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧 流速逐渐降低 最后甚至流不出 保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件 脱盐一般使用的是G 25属于硬胶 硬胶不易变形 受静水压的影响较小 6 检测在收集的同时 用20 磺酰水扬酸检测 加入奈氏试剂检测蛋白质中的硫酸铵 蛋白管中不出现棕色 合并纯化后的蛋白质管以待用 以光密度值为纵坐标 紫外检测 因时间长 以收集管的顺序号为横坐标 在坐标纸上绘图 可获具有一条洗脱峰的曲线 称为洗脱曲线 用以表示被分离物质流出的状态 7 凝胶的洗涤及保存由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用 所以无需 再生 只要用洗脱液冲洗后即可连续使