色谱翻译100520.doc

抗原表位分子印迹膜测量重合炭疽保护性抗原的反应和细分腔Dar-Fu Tai,*, Ming-Hong Jhang, Guan-Yu Chen, Sue-Chen Wang, Kuo-Hao Lu, Yu-Der Lee,and Hsin-Tzu Liu 东华大学 化学系 花莲、台湾 清华大学化学工程学院，新竹、台湾一种分子印迹膜被制备在表位肽上，然后转移到石英晶体微天平上的（QCM）芯片上。这5个肽通称为线性肽或构象表位的炭疽保护抗原PA83。印迹的结果是抗原与相应的模板亲和，随着基本单体的使用，结合效应进一步提高了向nanomolar水平增强的亲和力。具有亲和力的肽诱导其相应的分子聚合物（MIP）比诱导分析残留物分子更密切。所有的表位腔不同的保护性抗原表位的PA83区域以及相应的蛋白转换酶Furin均裂解为片段PA63和PA20，该芯片的QCM反应不同，在picomolar的范围内观察保护性抗原片段，从而证明了操作有明确方向的表面蛋白一种方法炭疽病，是一种急性传染病，是由炭疽芽孢孢子形成的，在机场，海关，战场等地方对这种危险的病菌做检疫和检查是个冒险的问题。当细胞感染了炭疽热，它们就会分泌三种蛋白质：保护性抗原(PA83, 83 kDa)，致命因子(LF, 90 kDa)，以及水肿因子(LF, 90 kDa)。保护性抗原（PA83），在大多数哺乳动物细胞内受体，（PA83）由弗林蛋白酶裂解为PA20和PA63，PA63是转换为heptameric环状齐聚物，形成较大的孔隙，允许LF和EF进入到细胞里面，PA83在炭疽病的致病原因中扮演了很重要的作用，PA83, PA63,和 PA20都认为是炭疽生物的标志物。 人类炭疽疫苗的活性成分，即保护性抗原，其晶体结构已被确定。此外，反PA83具有抗体的能力，可防止炭疽动物感染，控制PA83关键是要早诊断，缩短操作时间。一种新型保护性抗原识别检测系统具有极大的市场价值。一些抗体，被应用于保护性抗原的检测。分子印迹聚合物（MIP）已经成功地在模拟自然受体中表达。今天，已经有越来越多的直接蛋白质印迹被报告。然而，因成本问题致使这种方法的应用极其有限。蛋白质普遍是昂贵的，因此，一种廉价的可任意处理碎片的发展几乎是不可能的。在此之前，抗原表面方法已经证实：发展这些线性表位腔的多种优势，即：（1）蛋白抗原表位丰富，可以通过晶体结构和抗原表位显示映射，（2）抗原表位印迹结果表明，空腔有作为他们母体蛋白结合位点的功能，（3）抗原表位腔有足够的弹性蛋白和维护随后附件的天然构象蛋白质，（4）抗原表位腔能够操纵有明确方向的表面蛋白， 在制作上比使用组氨酸标记，生物素标记，特异性抗体络合等更容易、更便宜22。 在这方面，我们设计并合成了聚合物膜形成的几个表位腔，以进一步探讨epitope-cavities的大小和位置对表位腔的影响，他们能够正确地检测和证明炭疽存在于PA83，PA63，PA20。实验部分 （中银- L -半胱氨酸）丙烯酸，丙烯酰胺，酪胺，及中银-L-组氨酸均来自Sigma - Aldrich公司（圣路易斯，密苏里州）。N - Benzylacrylamide购于兰开斯特（兰开夏郡，英国），来自保护性抗原（PA炭疽）的合成肽（SPPS的探索）用微波合成。使用承担N -ACR -酪胺的载体酪Acrylation和（N -ACR - L -半胱氨酸- NHBn）2为原料来合成（中银- L -半胱氨酸）227，缓冲液为所有实验用的磷酸盐缓冲液（PBS）（20 mM的磷酸二氢钠，pH值7.0），QCM是从太田电子有限公司（台湾，台北）购买的。重复性为 1 Hz，QCM包括8毫米直径，10兆赫的AT切金电极（石英水晶制造磁盘，直径4.2毫米）。晶体保护性抗原（PA83）及其片段（PA63和PA20）使用的是纯化的rPA，由名单生物实验室（坎贝尔，加利福尼亚州）制备，其在评估过程中被作为商业冻干制剂。 由中银- L型与甲醇 酯化合成的ACR - L -组氨酸- NHBn，作为一种催化剂来形成木瓜蛋白酶叔丁氧羰- L -组氨酸甲酯。叔丁氧羰- L -组氨酸甲酯转化中银- L -组氨酸与木瓜蛋白酶存在于苄NHBn，脱去保护与三氟乙酸形成中银集团，其次与acrylation合成 ACR - L -组氨酸- NHBn 制备印迹聚合物涂层的QCM 在QCM上的磁性粒子被浸泡在10 mM，为期16小时的高效液相色谱级乙腈（n -的ACR - L -半胱氨酸- NHBn）2中，然后用乙腈冲洗彻底，无论丙烯酸或的ACR - L -组氨酸- NHBn（55mol），丙烯酰胺（55mol）的N - benzylacrylamide，或N -的ACR -酪胺（110mol），氮，N -二乙烯双丙烯酰胺（22mol）和3肽mol在0.3毫升溶液（乙腈混合/ 20mM，水）1:1）,重复 3次，沉积在上面的等分微升第（n -的ACR - L -半胱氨酸- NHBn）金电极芯片横放在20毫升含乙腈瓶（3毫升）的溶液中，紧紧密封小瓶，用波长为350 6小时紫外线灯照射，该聚合物，作为一个在金表面形成的薄膜，经20 mM的磷酸盐缓冲液（pH值）3-4）洗涤，删除模板，其次是与甲醇洗和烘干， 生物传感器系统，流动注射系统中包含着一个高效液相色谱泵（型号L7110，日立，流速）0.1毫升分- 1）若家里建流通池，其进样阀（型号1106，OMNIFIT）的QCM传感器（蚂蚁的P - Sensor2000，台湾），以及个人电脑等。该聚合物涂层的QCM是固定的两个O形圈，进入流通单元格中插入，只有三分之一的QCM接触液体，磷酸钠缓冲液（20mM，pH值7.0）是用于循环，清洗和检测。为了达到平衡，新印芯片很快!未定义的书签，空白，100微升解决方案，包括碱性（pH值9 PBS），中性（蒸馏水）和酸性（5乙酸蒸馏水），注射到细胞中循环流动 从表4的亲和力，PA83显示测量展出的超出值比PA63 Kd值略低，差异有可能是由构象变化引起的表位区域和质量差，对PA83规模得影响较大，他们必须在表面上占有较大面积，一旦蛋白印迹发生相互作用，PA83的大小和形状就会妨碍其他!未定义的书签，空计划进一步结合位芯片。此外，由于PA83分子量较大，实际上他们是不集中的。事实上，由于在芯片上抗原高浓度聚集，还有不足以结合的位点PA83。几种蛋白（胃蛋白酶，胰蛋白酶，和H -白蛋白）进行了检查，观察没有交叉反应，所有Kd值在picomolar范围内，浓厚的高分子蛋白质相互作用。从芯片的角度来看，PA659 - 672芯片的Kd值最低，出人意料的是，PA683 - 694芯片的表现优于PA681 - 694芯片，这与我们在图二中肽的检测不符，这一结果似乎与以前的报告矛盾，原因是抗原序列686-694互动与细胞受体，30日和序列680-692是一个线性关联的构象表位。结果和讨论PA83包含许多连结部位。抗原能辨别分布贯穿在PA83反应中认可的反应,它分布在整个PA83中。以前,4个抗原(671-721)领域被公认为包括抗：原决定簇的PA83装订细胞中581-601区域内的LA.11裹,更狭窄的肽序列686-694区域,被报道的细胞receptor.31 ，chymotrypsin-sensitive地点(312-315)也被报道在2.32域内，然而,抗体被发现位于认识因素1(PA20).6领域,同时还指出680-692序列的PA83.7,包括抗原决定簇)，运用这些结果,一个12 -含683-694倍肽的保护抗原(DKLPLYISNPNY)被选为模板生成epitopecavity首先,-diBoc-L-cystineN dibenzylamide是自动组装表面上的金与芯片。解决这一问题,包含了单体,epitope-peptide调控涂饰剂的添加与芯片的形成经紫外线照射形成高分子薄膜,先前described.20和洗Peptides-MIP片间的相互作用。这个MIP-grafted肽然后芯片使它们具有吸附性模板。N-Acryltyramine(ATA)被发现有更合适其的溶解度和N-benzylacrylamide为酸性识别网站的分析物。表1所示,赢得了senso的敏感性为了进一步改善!未定义的书签，空计划的制作，还必须与生产的酸性成分具有一个基本约束力的preorganized地区模板，手性氨基酸衍生物ACR - L -组氨酸- NHBn（AHB）在当时作为一项基本单体介绍。如表1所示，它有助于增加对分析物在低浓度时的特异性结合，更高的亲和力观察，同时，加入交联剂形成更严格的!未定义的书签，空和更稳定持久的QCM导入芯片从以前的电点报告为5.5蛋白质水平染色等Sterne PA83电聚焦（IEF）凝胶。要调整表位肽一项类似电点值，以获取抗原与相反电荷的腔基础设施。由于保护性抗原（PA83）是由裂解为PA20和PA63蛋白转换酶Furin转换的，不同表位肽的PA20和PA63被用来构建这些片段抗原表位筛选腔均会不同。确认属于其他四个肽的PA83作为模板选择的不同抗原表位的网站，如表2所示，选择性表位肽也调整到5.5等电点附近。合成的肽充当模板制作!未定义的书签，空的评价，从结合实验中得知，聚合物与抗原表位肽分子印迹能够有效地认识到模板，这些QCM芯片的频率位移显示：在500微克/ ml浓度附近的所有的情况下其处于饱和趋势。所获得的数据与饱和度方程绘制的特异性结合曲线，(B ) (Bmaxc)/(Kd + c), B ) H/Mw，其中C是蛋白质含量，B是!未定义的书签，空，分子量是分析物分子量，和H在QCM的频率变化），该肽的亲和力到MIPS衡量见表3所示。据发现，PA683 - 694芯片比PA681 - 694芯片有较高的Kd值。由于残留数长，Kd值较小因此，在同样的抗原表位的位置，与同类等电点越大。模板和更好肽残留量的数目是观察的约束力。对于14 -肽，解离常数为3和5纳米（PA659 - 672芯片）：优于12 - Mer的，10 - Mer的亲和力，和9肽，然而，这些表位腔，图1比较，显示了肽为MIPS亲和力更密切相关的，而不是数量的残留分析物分子的重量。例如，9 - Mer比10有更好的腔 -。它还表明，一个沉重14 - Mer的（PA681 - 694芯片）是一个比一个打火机（PA659 - 672芯片更好的选择），显然，该epitopepeptide，等电点，溶解度，构象的重量，其电荷分布均影响印迹效率，也许，有一个大的趋势，维持肽在聚合过程中较稳定的构象蛋白质，!未定义的书签，空芯片相互作用，!未定义的书签，空计划，然后嫁接肽芯片测试的能力，他们的亲体结合蛋白（PA83），其蛋白质PA20和PA63片段，如图2所示，所有的表位腔有效地认识到蛋白质PA83，对每个表位腔结合PA63频率响应如图3。所有的表位，除了PA71 - 79芯片腔有效地认识到蛋白质PA63是具有相同的抗原表位的结构的一部分相反，PA20只是绑定到PA71 - 79芯片。对PA20吸附到其他表位腔几乎无法察觉，因此，每个芯片显然认识到保护性抗原专门的吸附不同的区域。这样的络合诱导蛋白可以解决可能在使用某些方向的设计抗原表位腔。4结论：我们能够探测到保护抗原使用MIP-QCM炭疽病，它提供了一个方便的体外检测模式，定量识别蛋白质规模在毫微克的时间为30分钟。对模板分子高亲和力和目标蛋白质被观察到在picomolar范围内。该技术平台也可以作为一个快速和特定的免疫反应用来检测其他细菌抗原及各类蛋白质毒素。我们的研究结果也确定了这种复杂抗原的优势。首先，它通常适用于应用线性表面上产生的多肽分子印迹。第二，