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免疫共沉淀Co Immunoprecipitation理论与实验操作 wangxc 目录 免疫共沉淀的理论免疫共沉淀实验操作免疫共沉淀操作注意事项 一 免疫共沉淀的理论 免疫共沉淀 Co Immunoprecipitation 是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法 是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法 基本原理 细胞裂解液中加入抗体 与抗原形成特异免疫复合物 经过洗脱 收集免疫复合物 然后进行SDS PAGE及Westernblotting分析 但这种方法有两个缺陷 一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合 而可能有第三者在中间起桥梁作用 二是必须在实验前预测目的蛋白是什么 以选择最后检测的抗体 所以 若预测不正确 实验就得不到结果 方法本身具有冒险性 免疫沉淀反应 Immunoprecipitation 主要用于抗原或者抗体的定性检测 其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下 按适当比例所形成的可见沉淀物现象 据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验 环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验 凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类 Co IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的 proreinA 特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法 目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上 使之与含有抗原的溶液及抗体反应后 beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的 proreinA Ab Argarosebeads A B A B A B A A B 实验最需要注意点就是抗体的性质 抗体不同和抗原结合能力也不同 免染能结合未必能用在IP反应 建议仔细检查抗体的说明书 特别是多抗的特异性是问题 其次 要注意溶解抗原的缓冲液的性质 多数的抗原是细胞构成的蛋白 特别是骨架蛋白 缓冲液必须要使其溶解 为此 必须使用含有强界面活性剂的缓冲液 尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合 另一面 如用弱界面活性剂溶解细胞 就不能充分溶解细胞蛋白 即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果 抗原决定族被封闭 影响与抗体的结合 即使IP成功 也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果 TritonX 100 NP40是非离子界面活性剂 作用温和 SDS是离子性的强活性剂 再次 为防止蛋白的分解 修饰 溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂 低温下进行实验 每次实验之前 首先考虑抗体 缓冲液的比例 抗体过少就不能检出抗原 过多则就不能沉降在beads上 残存在上清 缓冲剂太少则不能溶解抗原 过多则抗原被稀释 欲速则不达 确定好比例很必要 准备 器械 微量高速冷冻离心机 移液枪 旋转盘 电泳设备 vortex震荡器 液氮及组织粉碎器 eppentube 试剂 细胞或组织 蛋白定量kit SDS电泳试剂 抗体 单抗时选择proteinG 二抗选择抗鼠Ig兔血清 PBS NaN3 proteinAsapharose 二 免疫共沉淀实验操作 试剂配制实验流程 试剂配制 RIPABuffer配制 基础成分 Tris HCl 缓冲液成分 防止蛋白变性 NaCl 盐份 防止非特异蛋白聚集 NP 40 非离子去污剂 提取蛋白 用H2O配制成10 储存液 去氧胆酸钠 离子去污剂 提取蛋白 用H2O配制成10 储存液 避光保存 注意 准备激酶 致活酶 实验时 不要加去氧胆酸钠 因为离子型去污剂能够使酶变性 导致活性丧失 RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 PMSF 用异丙醇配制成200mM的储存液 室温保存 EDTA 钙螯合剂 用H2O配制成100mM的储存液 PH7 4 亮抑酶肽 Leupeptin 用H2O配制成1mg ml的储存液 分装 20 保存 抑蛋白酶肽 Aprotinin 用H2O配制成1mg ml的储存液 分装 20 保存 胃蛋白酶抑制剂 Pepstatin 用甲醇配制成1mg ml的储存液 分装 20 保存 RIPA磷酸 酯 酶抑制剂激活的Na3VO4 用H2O配制成200mM的储存液 见SodiumOrthovanadateActivationProtoco NaF 200mM的储存液 室温保存 注意 在准备做磷酸 酯 酶实验的时候 不加磷酸酯酶抑制剂 工作液配制 配制100ml的modifiedRIPAbuffe 1 称取790mg的Tris Base 加到75ml去离子水中 加入900mg的NaCl 搅拌 直到全部溶解 用HCl调节PH值到7 42 加10ml10 的NP 403 加2 5ml10 的去氧胆酸钠 搅拌 直到溶液澄清4 加1ml100mM的EDTA 用量筒定容到100ml 2 8 保存 5 理论上 蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入 抑蛋白酶肽 亮抑酶肽 胃蛋白酶抑制剂各100 l PMSF Na3VO4 NaF各500 l 但是PMSF在水溶液中很不稳定 30分钟就会降解一半 所以PMSF应该在使用前现加 其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天 各种成分在工作液中的终浓度 Tris HCl 50mM pH7 4NP 40 1 去氧胆酸钠 0 25 NaCl 150mMEDTA 1mMPMSF 1mM抑蛋白酶肽 亮抑酶肽 胃蛋白酶抑制剂 各1 g mlNa3VO4 1mMNaF 1mM 准备工作 预冷PBS RIPABuffer 细胞刮子 用保鲜膜包好后 埋冰下 离心机1 用预冷的PBS洗涤细胞两次 最后一次吸干PBS 2 加入预冷的RIPABuffer 1ml 107个细胞 10cm培养皿或150cm2培养瓶 0 5ml 5 106个细胞 6cm培养皿 75cm2培养瓶 3 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下 把悬液转到1 5EP管中 4 缓慢晃动15min EP管插冰上 置水平摇床上 4 4 14000g离心15min 立即将上清转移到一个新的离心管中 5 准备ProteinAagarose 用PBS洗两遍珠子 然后用PBS配制成50 浓度 建议减掉枪尖部分 避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6 每1ml总蛋白中加入100 lProteinA琼脂糖珠 50 4 摇晃10min EP管插冰上 置水平摇床上 以去除非特异性杂蛋白 降低背景7 4 14000g离心15min 将上清转移到一个新的离心管中 去除ProteinA珠子8 Bradford法 做蛋白标准曲线 测定蛋白浓度 测前将总蛋白至少稀释1 10倍以上 以减少细胞裂解液中去垢剂的影响 定量 分装后 可以在 20 保存一个月 9 用PBS将总蛋白稀释到约1 g l 以降低裂解液中去垢剂的浓度 如果兴趣蛋白在细胞中含量较低 则总蛋白浓度应该稍高 如10 g l 10 加入一定体积的兔抗到500 l总蛋白中 抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11 4 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h 激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12 加入100 lProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物 4 缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h 如果所用抗体为鼠抗或鸡抗 建议加2 l 过渡抗体 兔抗鼠IgG 兔抗鸡IgG 13 14000rpm瞬时离心5s 收集琼脂糖珠 抗原抗体复合物 去上清 用预冷的RIPAbuffer洗3遍 800 l 遍 RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠 抗原抗