「葡萄糖氧化酶活力测定(分光度法)」.doc

葡萄糖氧化酶活力测定（分光度法）1.原理（1）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每个酶分子中含有两单位FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸），作为受氢体催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并产生过氧化氢。C6H12O6+O2=氧化酶 C6H12O7+H2O2在一定时间内葡萄糖经氧化酶催化发生反应后，测定其反应液的过氧化氢浓度即可算出葡萄糖氧化酶的活力。（2）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在一定pH值的缓冲溶液中和加热条件下能使靛蓝胭脂红发生褪色反应，并且其反应速度在一定范围内和过氧化氢浓度成正比，据此测定出产生的过氧化氢的量，进而计算出葡萄糖氧化酶活力。（3）首先利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应，在615nm波长处测定吸光度，建立标准曲线。然后，作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应，再取其反应液与一定浓度的靛蓝胭脂红溶液反应随后测定其在615nm波长处测定吸光度，将吸光度值代入标准曲线方程后可推算出氧化酶活力。2药品（1） 0.2mol/L葡萄糖溶液:称取3.96g一水葡萄糖定容于100.00mL冷藏3小时备用，2天内有效。（2）1010-3mol/L靛蓝胭脂红溶液：称取0.466g靛蓝胭脂红定容于1000mL。（2） 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH=5.2)：称取16.16g三水醋酸钠及2.48g冰醋酸定容至1000mL（4）12mg/L过氧化氢标准溶液：准确称取0.040g 30%的过氧化氢溶液（过氧化氢需事先标定取实际值）定容于1000mL。3实验方法（1）标准曲线的绘制准确吸取0、1、2、3、4、5、6mL过氧化氢标准溶液(12mg/L)，分别置于25mL比色管中，加人1.3mL靛蓝胭脂红溶液(1010-3mol/L)和30mL乙酸一乙酸钠缓冲液，再加人蒸馏水稀释至25mL配成含有过氧化氢0.00mg/L、0.48 mg/L、0.96 mg/L、1.44 mg/L、1.92 mg/L、2.40 mg/L、2.88 mg/L的溶液，于沸水浴中加热13min后，用流水冷却比色管5min。用1cm比色皿，以蒸馏水作参比，在波长615nm处测定其吸光度，以吸光度对过氧化氢浓度作图（分光度作横坐标，过氧化氢浓度为丛坐标）得标准曲线方程。（2）按酶活大小称取适量葡萄糖氧化酶以醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至约6U/mL的浓度，某些酶产品水溶性很差，加稀释液混均定容好后需过滤取滤清夜测定。（3）将稀释好的酶液置于37水浴中计时保温5分钟。（4）吸取2.00mL葡萄糖溶液置于比色管中，将其放入37水浴中计时保温5分钟。（5）保温时间到后吸取2.00mL酶稀释液加入上述预放有2.00mL葡萄糖溶液的比色管中混匀，保温反应10分钟。（6）取出比色管转置于冰浴中，同时取一25mL具塞比色管中，分别加入乙酸一乙酸钠缓冲溶液30 mL和1.3mL的靛红溶液，再加入1mL的上述反应液，稀释至刻度，于沸水浴中加热13min后，取出用流水冷却5min，终止反应。（7）用1cm比色皿，在波长615nm处，以蒸馏水作参比，测定其吸光度A0。（8）空白样测定时，先加三氯醋酸后加酶稀释液，其余各步凑相同。4计算葡萄糖氧化酶活力定义为：37条件下，1min内催化葡萄糖反应产生1g过氧化氢（H2O2）所需的酶量为1U。X0=（(A-A0)*K+C0）*25*10-3*103*（4/1）*（1/2） /10（(A-A0)*K+C0）*5X= X0*N/mX0：酶稀释液的酶浓度，U/mLA：样液的吸光度值A0：样液的吸光度值K：标准曲线的斜率C0：标准曲线的截距25：反应液稀释25倍10-3：单位换算，毫升转为升103：单位换算，毫克转为微克4/1：从4毫升反应