4-真菌的营养-2.doc

第四章 真菌的营养 营养和生长是密切相关的，营养是生长的基础，生长是营养的一种表现形式。 真菌的营养方式可分为腐生性和寄生性两大类，对营养物质的要求有差异。 第一节 消化和吸收一、 消化真菌能够生长的基质非常广泛。简单的糖和氨基酸等小分子的营养物质，菌丝可以直接吸收大分子的不溶性的多聚物，如纤维素、淀粉、蛋白质等在被利用前需初步的消化。 真菌能够分泌胞外酶去水解大分子变为小分子胞外酶大都是消化酶，具有专一性，只能控制那些营养需要的大分子水解。多聚物的消化是一个逐步过程，涉及许多不同的酶 真菌消化能力，依靠真菌分泌的胞外酶，只有当真菌与基质发生联系时这些酶才发挥作用。二、吸收 进入真菌细胞的所有离子和分子必须通过细胞壁和质膜。细胞壁本身是多孔的，一般情况下允许离子和分子通过。质膜是一种半透性的膜，自身可以调节溶质运输到细胞中。溶液中的非电解质可以通过浓度梯度，从高浓度向低浓度运动。溶液中的离子同样可以穿过细胞膜，但是它的推动力是依靠不同的电化学电位溶质以主动运输的方式进入细胞中，其原理涉及到原生质膜上的载体分子，靠载体运输溶质穿过原生质膜，而载体系统的启动需要由ATP提供能量。简单的扩散也涉及到载体系统，但它不同于主动运输过程，不能逆浓度梯度扩散，溶质是从高浓度向低浓度扩散穿过质膜被运输。 几乎所有重要的离子是通过主动运输被吸收的，包括阳离子（如钾、镁、锰、铁和铅等离子）和阴离子（如磷酸根和硫酸根等阴离子）。K+的吸收是显著的高效率的，只要从呼吸中提供能量，K+吸收则可以在浓度梯度达到5000:1的状态下进行，但是K+的吸收是与H+向胞外运输相匹配。在某些情况下，一种离子的吸收往往受其它离子的影响，例如，在酵母菌中，当PO43-吸收时，Mg2+、Ca2+和Mn2+的吸收也同时发生，而且K+刺激这一吸收作用的进行。 非电解质的吸收几乎都依赖于专门的运输系统来完成。糖类的吸收可通过主动运输和简单扩散；氨基酸的吸收通过主动运输；有机酸的吸收是通过专门运输和被动扩散。专门载体分子（透性酶）是为每一种营养物质运输而产生的，受许多内外因素所制约，如pH、温度、营养物的特殊结合以及真菌自身的生理条件等。三、酶诱导和抑制 营养物质的吸收在很大程度上取决于酶和酶活性，消化酶分解培养基中的大分子，质膜上的载体分子也是一种酶，称为透性酶。 具有特殊功能的酶不一定总是在细胞中出现，而这种酶的合成可以由一种特殊的营养物所诱导。有些真菌不含有消化淀粉的酶，但是当它被转移到含有淀粉的培养基上时，它可被诱导产生所需的酶去分解和利用淀粉。有些氮素营养物，如硝酸盐和亚硝酸盐，也需要由酶诱导的形式被真菌吸收和利用。 一种营养物质的吸收将会受到另一种同样需要的营养物质的影响，例如，在培养基中加入混合的糖源，真菌首先利用葡萄糖而不能吸收另外也需要的果糖，直到葡萄糖被耗尽才能利用果糖。这种现象叫做分解产物抑制。磷酸根抑制亚磷酸盐的吸收；含硫氨基酸抑制硫酸盐的吸收；铵或谷氨酰胺抑制硝酸盐的吸收；硝酸盐抑制亚硝酸盐的吸收。机理：负责运输代谢物穿过质膜的载体分子没有预先合成，或者是利用这种代谢物的代谢途径中的酶被改变。 酶诱导和抑制是由基因控制的，涉及到结构基因和调节基因结构基因直接编码酶调节基因是调控酶的表达调节基因的正调控对于结构基因的表达是需要的调节基因的负调控导致结构基因的表达被抑制第二节 碳素营养真菌细胞干重的一半是由碳组成的，重要性。碳提供了两种基本的功能(1)它对细胞关键组分的合成提供了所需的碳素，而且构成这些关键组分的基本骨架。例如，碳水化合物（糖类）、蛋白质、脂肪和核酸等；(2)碳源的氧化过程为真菌基本生命过程提供了能源。 真菌做为一个类群，能够利用大量种类的碳源，这些碳源的范围从小分子的糖、有机酸、乙醇到大分子的多聚物，如蛋白质、脂类、多糖和木质素等。一、 单糖和双糖 单糖真菌利用单糖及其衍生物的能力差异较大，尽管某些单糖在生化性质方面是密切相关的，但是不同种的甚至同种而不同株系的真菌，对其都有它自己的选择。l 葡萄糖、半乳糖、甘露糖都是六碳的已醛糖，其中葡萄糖几乎是所有真菌都喜欢利用的良好碳源，甘露糖次之，半乳糖也可被许多真菌利用。l 果糖是五碳的酮醛糖，是仅次于葡萄糖的良好的碳源。其它的单糖，如山梨糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖都是很少被真菌利用的单糖，可能对一些个别的真菌是很好的碳源。例如，在木糖上生长的某些真菌与在葡萄糖上生长的一样好。真菌利用某一单糖的能力依赖于它被转化成磷酸化的葡萄糖衍生物的难易程度，因为这个衍生物可以进入呼吸途径。l 许多糖醇，如山梨糖醇、甘露糖醇和甘油等，可以被真菌吸收做为碳源利用，但是通常不及单糖的效果好。甘露糖醇是一个例外，因为它是从果糖或甘露糖还原衍化而来，它可以使一些真菌获得与在葡萄糖上同样的生长效果。双糖许多真菌能够利用单糖而不能利用同一种单糖组成的双糖或较大分子的糖，这归因于这些真菌缺乏分解双糖的能力。l 最普遍存在的双糖有麦芽糖、纤维二糖、蔗糖和乳糖。麦芽糖是淀粉水解的产物，由葡萄糖分子通过糖苷键连接组成；纤维二糖由葡萄糖分子组成，是通过糖苷键连接，纤维二糖是纤维素的分解产物；蔗糖是一分子葡萄糖和一分子果糖；乳糖是牛奶的成分，是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖组成。这些双糖可分别由麦芽糖酶、纤维二糖酶、蔗糖酶和乳糖酶消化。麦芽糖和纤维二糖被真菌广泛利用，少数真菌利用蔗糖，更少数的真菌利用乳糖。l 在碳源利用中的这些差异的生理学基础是什么呢？在所有真菌中，能够利用低分子量的碳水化合物做为碳源主要依赖于(1)一种专门载体蛋白携带转移通过原生质膜；(2)取决于这种碳源化合物进入细胞后的生化代谢途径中能量的释放和各种酶的形成。如果缺乏相应载体或生化代谢途径中酶的改变，都会影响对碳源的吸收和利用。l 啤酒酵母对糖的转移运输系统啤酒酵母对糖的转移运输系统，一般来说可以做为碳源吸收的模式体系。在啤酒酵母中主要糖的吸收系统扼要的摘于表4-2中。表4-2 啤酒酵母中基本的糖吸收系统 携带系统 被转移的糖的样品 基本的/诱导的非特异性的吡喃糖系统 D-葡萄糖 L-葡萄糖 2-脱氧-D-葡萄糖 D-果糖 D-木糖 D-甘露糖 D-阿拉伯糖 D-来苏糖 D-山梨糖基本的半乳糖系统 D-半乳糖 D-墨角藻糖 D-木糖 D-阿拉伯糖 D-古洛糖半乳糖诱导的双糖系统 D-葡萄糖 麦芽糖 海藻糖可诱导的非特异性a-甲基-D- 葡糖苷系统 D-葡萄糖 麦芽糖 海藻糖 a-甲基-D-葡糖苷 a-硫乙基-D-吡喃葡糖苷可诱导的对于葡萄糖和结构相似的糖至少有一个转移系统，这一系统是基本的另外三种吸收系统是可诱导的，它们只是在培养基中加入一定的诱导物后才能形成。例如，当一个生长旺盛的培养菌株从葡萄糖培养基上转移到含有半乳糖为主要碳源的培养基中，菌株生长变慢甚至停止生长，这是由于基本转移系统不能运输半乳糖的原因。当继续培养4小时后（或更长时间），半乳糖的吸收增加而恢复旺盛的生长。在这一时间内，转移半乳糖所涉及的携带蛋白的基因密码被翻译，从而合成新的依赖蛋白，使菌株恢复生长，这被称做适应性生长。像表4-2中所列的半乳糖系统中被转移的五种糖，半乳糖依赖蛋白可以运输它们，然而半乳糖是唯一有效的诱导物。有人曾指出半乳糖诱导过程中并没有合成一个新的载体，而是一种“透性酶(permease)”催化了半乳糖的结构。 为了诱导半乳糖载体（或是产生透性酶），必须有半乳糖同时葡萄糖不能存在。假若在半乳糖培养基中加入葡萄糖，那么半乳糖的吸收会停止而开始利用葡萄糖，这可能是半乳糖携带蛋白被葡萄糖的基因密码所抑制，而合成葡萄糖的携带蛋白。因为在其它糖类存在的情况下，葡萄糖优先被基本的吸收系统所利用，只有在葡萄糖被基本系统用尽的时候，细胞将利用能量去合成一个新的携带系统来维持生存。l 糖的吸收是以协助扩散和主动运输两种方式来完成的。在啤酒酵母中，半乳糖的吸收在未诱导的细胞中是协助扩散，在被半乳糖诱导的细胞中是主动运输。葡萄糖的吸收也是采用了协助扩散和主动运输，海藻糖和麦芽糖的吸收是主动运输。 二、大分子碳水化合物的利用 许多真菌能够利用寡糖和多聚糖做为碳源，但这些分子完整的转移进细胞是太大了。必须首先水解为亚单位。许多真菌能够分泌各种酶到周围环境中分解复杂的碳水化合物。这些酶包括纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、几丁质酶、聚葡萄糖酶、木聚糖酶、-1.3-葡聚糖酶，甚至DNAase和RNAase。 （一）纤维素 纤维素是存在于植物组织中的多聚糖，对真菌来说它是自然界中有潜力的碳源。许多植物病原真菌和腐生真菌能产生分解纤维素的一系列酶，通称纤维素酶。过程：不溶性的结晶纤维素 C1纤维素酶 可溶性的纤维素 可溶性的纤维素 Cx纤维素酶 单糖纤维二糖 纤维二糖酶 葡萄糖许多真菌能够合成这种复合的纤维素酶，使它能够降解各种纤维素的结构，在自然界物质循环中起着重要的作用。 （二）淀粉 淀粉是另一种植物多聚糖。淀粉能够被大多数真菌利用，利用淀粉做为碳源的真菌，在其培养基中能够检测出淀粉酶的存在。如果培养基中淀粉被其它碳源所替代，那么淀粉酶的产生明显下降，甚至停止分泌。由此证明淀粉酶是一个可诱导的酶，只有在淀粉存在时它才能被合成。（三）木质素 木质素是多年生植物的主要组成成分，在自然界它是仅次于纤维素的丰富的有机多聚物，它对于寄生和腐生真菌来说是一种具有广泛潜力的碳源。木质素这一名称是一个密切相关的、结构复杂的、高分子量的化合物类群，它是包括三个取代醇的聚合物，这三个取代醇是香豆素醇、松柏苷醇和芥子醇(图4-3)，这些亚单位的相互比例因种而异。香豆素醇，R1=R2=H松柏苷醇，R1=H，R2=OCH3芥子醇，R1=R2=OCH3图4-3 木质素的结构图 木质素的结构使它阻止了大多数微生物的利用，而某些真菌类群能够利用它作为碳源。能够利用木质素的真菌主要是白腐菌(white-rot)和少量的担子菌，此外，还有褐腐菌(brown-rot，担子菌)和软腐菌(soft-rot，子囊菌)以及一些局部降解木质素的半知菌。 对木质素降解的机制目前知道的较少，只知道真菌产生的胞外酶氧化芳香环和脂肪族的侧链，产生低分子量的产物，然后被真菌利用。酚氧化酶如漆酶和过氧化物酶是木质素降解中不可缺少的酶，实验已证明不能产生酚氧化酶的真菌不能降解木质素，同时也证明在木质素降解中酚氧化酶并不是唯一的酶，涉及一些其它的酶系统。 三、醇类 某些真菌能够利用醇类做为主要碳源。酵母菌是工业上重要的生产菌，它能由发酵反应产生酒精。产朊假丝酵母(Candida utilis)培养在含有乙醇或丙烷醇的培养基上，获得了大量的生长，但是在其它的醇类上几乎不生长，同时用乙酸和乙酸盐做为对照，虽然能够生长，但是生长量不及乙醇或丙烷醇。构巢曲霉(A.nidulans)能在乙醇做为碳源的培养基上生长并产生分生孢子，产孢过程乙醇比葡萄糖更有效。假密环菌(Armillariella mellea)，乙醇、丙醇和丁醇都是优秀的碳源。裂褶菌(Schizophyllum commune)在乙醇培养基上生长的很弱毛盘孢属(Colletotrichum)和盘长孢属(Gloeosporium)的一些种不能利用乙醇。 多羟醇也能被许多真菌做为碳源利用，甘油就是多羟醇做为碳源的良好材料。对Hansenula miso(一种汉逊氏酵母)，进行了各种醇类做为碳源的实验，发现乙醇和甘油（丙三醇）是最好的碳源，而且超过了葡萄糖的效应。四、脂肪酸和碳氢化合物 许多真菌能够利用多种非极性的分子做为碳源，如脂肪酸、甘油三酯和碳氢化合物。（一）脂肪酸 能够被真菌利用的脂肪酸依赖于碳氢链的长度图：在含有硝酸盐的培养基中加入不同链长的脂肪酸做为主要碳源，培养剌孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)所获到的。含有14-18个碳的长链脂肪酸在四种不同的pH下都能被利用，而短链脂肪酸被真菌利用的关键因子是pH，例如，C2-C8脂肪酸在pH6.5-8.0时是一种好的碳源，而对于C10-C12正相反，在pH5.5时，C10-C12是一种好的碳源，而C2-C8脂肪酸较难利用。图4-4 初始pH与脂肪酸链长度对剌孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)生长的效应 脂肪包括甘油三酯也可做为碳源，许多种真菌能分泌脂肪酶进入周围环境，水解脂类为亚单位，较容易地进入细胞。脂酶的产生受营养和环境条件的限制，例如，产黄青霉(Penicillium chrysogenum)在温度为30，pH6.0时脂酶产量最大，而且摇床培养比静止培养要好。在白地霉(Geotrichum candidum)培养中，脂酶是一种可诱导的酶，这种酶的合成是以培养基中存在脂肪为触发。 无论在何种情况下，脂肪或是它的化合物不能做为主要碳源，但它们在培养基中明显地影响真菌的生长。例如，当各种脂肪酸做为主要碳源时，假密环菌，白地霉都不能很好的生长，然而在这种培养基中加入葡萄糖，它们的生长量增加了。研究指出各种商业用油，例如，棉仔油、玉米油、亚麻子油能刺激双孢蘑菇菌丝的生长，这或许是脂类具有生长因子的功能，或许是帮助了基质的被利用。同时还发现高浓度的脂肪酸能降低磷酸盐的吸收和呼吸作用，这可能解释了脂类不能做为主要碳源的原因。 （二）碳氢化合物 碳氢化合物也是真菌喜欢利用的一类碳源物质。近年来由于石油工业的发展，发现许多利用烃类的霉菌和酵母菌。如：枝孢属(Cladosporium)、粘鞭霉属(Gliomastix)和假丝酵母属(Candida)等真菌是典型的航空燃料油的污染菌，其它真菌也被发现能在柴油、煤油和石蜡油基质上生长。从原油中分离出40-60种真菌，并揭示出真菌能够利用原油。航空燃料油中酵母菌的生长可提供低凝固点的航空油和石油蛋白。在假丝酵母属中有36种55个株在含有C11-C12或C18的碳氢化合物上生长旺盛。碳氢化合物做为碳源，在其生长培养基中补加脂肪酸往往能提高效果，如：生长在2%石蜡油的一株红酵母(Rhodotorula glutinis)，在培养基中补加0.25%的油酸，其生长增加两倍。热带假丝酵母(C.tropicalis)能够在碳氢化合物的基质上生长，加入0.005-0.01%的脂肪酸能提前达到对数生长期。碳氢化合物能够直接在原生质膜的类脂中溶解而进入细胞，这只限于能够支持生长的碳氢化合物进入细胞，是有选择性的。如：热带假丝酵母从一种葡萄糖培养基转移到一种含有链烷做碳源的培养基上时，在细胞壁表面形成一种甘露聚糖脂肪酸复合物来吸收链烷，这种可诱导的复合物助长了非极性的碳氢化合物从培养基中运输到细胞表面。 五、固定CO2 多数真菌不能利用CO2做为主要碳源，但许多真菌具有固定CO2的能力。少数的种已经被证实可以利用CO2做为主要碳源，如头孢霉属(Cephalosporium Spp.)的一些种和镰刀菌属(Fusarium Spp.)的一些种，当它们在完全无机的培养基上生长五年后，补加煤气或HCO3-后能够利用14CO2。在生长的初始阶段，补加的CO2浓度和生长速率之间呈线性关系。如果补加的气体经过硫酸清洗除去一些微量的污染物后(但不包括CO2)，头孢霉的生长速度降低，这一现象证实它们除了确实能够利用CO2做为主要碳源外，也能够利用空气中存在的微量有机物。一些真菌在利用其它碳源时，固定CO2似乎是必需的。当把黄萎轮枝孢(Verticillium albo-atrum)培养在含有1%葡萄糖或甘油做碳源的培养基上时，如果缺乏CO2，那么90%以上不能生长。小结 在这一节中，我们仅仅描述了被真菌利用的碳源的一般类型。单糖和双糖、碳水化合物、醇类、脂肪酸和碳氢化合物以及CO2的固定，这些碳源在被吸收和利用的过程中都受到化学的、物理的、机体本身的和环境等因子的影响。 碳元素是所有细胞的结构和功能的基本要素，因此对于生活机体的生存是极端重要的，几乎所有异养的真菌都依赖于对周围环境中的复杂形式碳的降解。大多数异养的(吸收)真菌，在它们利用碳素生长和发育之前，运输这些复杂分子通过原生质膜。然而原生质膜几乎是所有碳源运输的屏障，所以从周围环境中吸收碳源的适应性系统逐渐形成。 首先，真菌分泌胞外酶，例如，纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、酚氧化酶等，降解大分子的碳水化合物为可吸收的小分子的亚单位。其次，真菌有专门的吸收系统运输这些亚单位通过质膜，这些运输系统是永久存在的或是可诱导的。做为某些脂类的吸收是简单扩散，而大多数的碳源吸收是经过协助扩散和主动运输，在主动运输中菌体能够制造一个特殊的环境，使其与细胞内的浓度梯度相比碳源差不多可以完全被转移进细胞内。第三节 氮素营养氮源对于真菌的生长和发育是不可缺少的，它的作用主要是合成各种关键的细胞组分，包括氨基酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶、核酸、氨基葡萄糖、几丁质以及各种维生素等。 一、氮源利用的一般途径 根据真菌对分子氮(N2)、硝酸盐、亚硝酸盐、氨和有机氮化物的利用，被划分成四类营养等级（表4-6）。目前没有明确的证实真菌能够固定分子氮。表4-6 真菌对氮源利用的类型 氮 源 等 级 - N2 NO3- NO2- NH3+ 有机氮 1 ? + + + + 2 + + + + 3 + + 4 +硝酸盐还原酶亚硝酸盐还原酶羟氨还原酶N-乙酰氨基葡萄糖嘌呤、嘧啶酰胺、 硫脲 等降解物NADPH Cu、FeNADP尿素CO2NADPH Mo、FeNADPNADPH Mg、MnNADP谷氨酸其它氨基酸氨基酸库几丁质磷质嘌呤嘧啶维生素蛋白质DNA、RNANO3-NO2-NOH?NH2OHNH4图4-5 氮源利用的一般途径大多数真菌在培养基中补加无机或有机氮源时都能生长，这属于表4-6中的第二类。一些真菌能够利用氨和有机氮，但是不利用硝酸盐，这些归于第三类，仅有很少数的真菌只能利用有机氮源，这属于第四类。 真菌做为一个类群能够利用许多不同的化合物做为氮源，已经用硝酸盐、亚硝酸盐、氨、氨基酸和尿素做了大量的实验。这些化合物之间是可以互相转换的，在图4-5中显示了氮源利用的一般途径和它们之间的转换关系。 二、硝酸盐的利用 大多数真菌能够利用硝酸盐硝酸盐同化的代谢路线是由硝酸盐还原酶还原为氨，硝酸盐还原酶催化从NADPH转移电子到硝酸盐，而且需要Mo2+和Fe2+做辅助因子。但某些真菌类群不能利用硝酸盐，这可能是由于它们不能合成硝酸盐还原酶的缘故。 已经对许多真菌进行了硝酸盐吸收的研究，例如，啤酒酵母、构巢曲霉、粗糙脉孢菌和产黄青霉等，充分证实了硝酸盐的吸收直接关系到硝酸盐还原酶的活性。图4-6中显示了构巢曲霉标准株和缺少硝酸盐还原酶突变株对15N-硝酸盐的吸收。这两个菌株都能生长在脲素培养基上，然后从脲素培养基上转移到15N-硝酸盐培养基上，在转移前细胞内15N的含量是丰富的，而转移后15N的吸收延迟了40分钟，这有两种可能，(1)等待硝酸盐还源酶的产生；(2)证明这种酶是可诱导的酶。如果把两个菌株转移到硝酸盐氨的培养基上，标准株不吸收硝酸盐，而且也缺少硝酸盐还原酶，依此而得出一个结论，氨是一个影响硝酸盐还原酶产生的阻遏物。图4-6 构巢曲霉标准株与缺失硝酸盐还原酶突变株对硝酸钾(15N)的吸收()硝酸盐培养基上的正常细胞 ()硝酸盐氨培养基()在硝酸盐培养基上的突变株细胞 ()在硝酸盐氨培养基上的突变株细胞 硝酸盐是如何被吸收的？硝酸盐是借助于硝酸盐还原酶作用引起硝酸盐浓度下降而进入细胞。因此，硝酸盐可能经简单的扩散或是硝酸盐还原酶有助于扩散而进入细胞。 有人指出，假若硝酸盐还原酶活性的确与硝酸盐吸收相关，那么这种酶可能存在于原生质膜或接近原生质膜，而且已经用免疫化学的方法证实，硝酸盐还原酶存在于细胞壁和细胞膜之间以及液泡膜上。 三、亚硝酸盐的利用 尽管亚硝酸盐可以做为氮源被一些真菌利用，但是它对许多真菌是有毒的，图4-7中显示出高浓度的亚硝酸盐对粗糙脉孢菌生长的抑制效应。亚硝酸盐的毒性可能归因于它对氨基酸的脱氨基作用和干扰硫代谢的能力。亚硝酸盐对粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)生长的抑制作用 在图4-5中，亚硝酸盐变为氨的一系列步骤还不完全了解，亚硝酸盐首先与亚硝酸还原酶反应，要求铜和铁离子做复合因子，催化电子从NADPH向亚硝酸盐转移。这一反应的中间产物不清楚，最后形成羟胺，在羟胺还原酶的作用下形成氨。 Pateman和Kinghorn设计了与硝酸盐实验相似的方法，用构巢曲霉标准株与亚硝酸盐还原酶缺失的突变株测定15N-亚硝酸盐的吸收。实验结果证实亚硝酸盐的运输和吸收与亚硝酸盐还原酶相关，而且氨抑制该酶的合成。 四、氨的利用 绝大多数真菌能够利用氨做为主要的氮素营养，真菌通常优先利用氨。氨化合物的种类广泛，包括硫酸氨、氯化铵、磷酸铵、硝酸铵、酒石酸铵等。NH4NO3和(NH4)2SO4做氮源时，培养基的最终pH变的很低，这主要是因为NH4+被利用后剩余的NO3-和SO42-的缘故，故而称做生理酸性盐。如果加入适量的缓冲盐类可调节pH以稳定反应，如磷酸盐类和碳酸钙。 如：向硝酸盐培养基中加入氨后，结果：真菌停止对硝酸盐的吸收，但硝酸盐的存在并不影响氨的吸收，原因：由于反馈抑制，氨抑制硝酸盐还原酶的产生，最终产物抑制了酶的形成。因为氨抑制硝酸盐还原酶，因此也就抑制了硝酸盐向亚硝酸盐转化。 在细胞内部，氨能够借助三个基本的反应进入氨基酸。 五、尿素的利用 尿素的产生：是在降解嘌呤、嘧啶和精氨酸这些化合物时产生的，形成的尿素能够用作生长的氮源，也能用来补加到培养基中。尿素被吸收后在细胞内首先转换为氨，因此，生长在尿素培养基上的啤酒酵母和生长在含氨的培养基上的啤酒酵母是相匹敌的。 用14C-尿素在酵母菌和丝状真菌中进行了尿素吸收的试验，在啤酒酵母中有两种尿素转移系统存在。第一是主动运输系统，这是在低浓度下的一种效应，这个系统是被尿素诱导的而且能被好的氮源，如天冬氨酸和谷氨酰胺所抑制。另外，尿素能够用促进扩散的方式吸收。这是在高浓度下的效应(500M)，这一系统的携带者即不被诱导也不被抑制。 六、有机氮的利用大多数真菌能够利用有机氮做为氮源，但不是全都能很好的利用。真菌能够分解自然界中的蛋白质变成可被吸收的氨基酸。真菌对于不同的氨基酸有着不同的要求天冬酰胺是一种良好的有机氮源，甘氨酸、谷氨酸以及天冬氨酸一般也是真菌喜欢的氮源。混合的氨基酸要比单一氨基酸对真菌生长更有利。 真菌利用蛋白质和多肽的能力是依赖于真菌分泌蛋白酶分解大分子为较小基质的能力，许多真菌通过转移系统吸收短链的肽。嘌呤和嘧啶做为氮源是能够被真菌利用的，包括构巢曲霉、粗糙脉孢菌、产黄青霉、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)和大量的酵母菌。在酵母菌的研究中证实被利用的嘌呤和嘧啶类有：腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、尿酸、胞嘧啶、尿嘧啶、二氢尿嘧啶、胸腺嘧啶和二氢胸腺嘧啶。 小结在这一节中，我们描述了真菌对氮源利用的概况，硝酸盐、亚硝酸盐、氨盐、尿素以及有机氮，这些氮源物质在被真菌吸收和利用的过程中，都受到化学的、物理的、机体自身和环境因素的影响。第四节 无机营养在真菌培养过程中，当培养基中缺乏某些无机元素时，就会导致菌体生长缓慢或繁殖能力降低，这些无机元素被称为必需的无机营养元素。无机元素的主要功能是构成细胞的主要成分，作为酶的组成部分并维持酶的活性，调节细胞渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等。真菌所需的无机元素的量与碳源和氮源相比是很低的，一般每升培养基只需要几百毫克。对于不同的菌株，不同的培养基以及不同的培养环境来说，维持菌体最大生长速度所需要的无机元素的量是不同的。根据所需的无机营养的量将无机元素分为两类，常量元素为Mg、P、K、Ca、S等。另一类为微量元素，也叫痕量元素，即所需的量比较小，包括Cu、Fe、Zn、Mn、Mo等，有些菌也需要其它元素如B、Co、Na等元素，但由于试剂及水中存在着痕量金属使得很难确定它们是否为必需的。 在这一节中，我们主要讨论重要的常量元素和痕量元素，重点在于它们的吸收方式、生化功能以及对生长发育的影响。一、镁 镁是真菌需要的并起广泛调节作用的无机元素。不同的菌株及不同的培养基组分使得细胞内Mg2+的变化较大，但是在正常情况下细胞内Mg2+的浓度与培养基中Mg2+浓度成正比，然而当外界Mg2+浓度增加时，细胞内的Mg2+浓度表现出一定的稳定性，例如当外界浓度增加到1400倍时，细胞内的Mg2+浓度只增加1.5-3.3倍。细胞内的Mg2+浓度是受菌体生长速率的影响，例如马格内孢霉(Endomyces magnusii)和产黄青霉(P.chrysogenum)快速生长时，细胞内的Mg2+浓度变低。 磷对于Mg2+含量的影响说明磷可能参与了Mg2+的吸收，Rothstein等人用酵母菌做实验证明磷和低浓度的钾能促进Mg2+的吸收。其它二价离子钴、锌和低浓度的锰、锶由同一载体运输，同时二价离子的吸收都涉及K+和Na+的分泌。 在细胞内，Mg2+参加了大量的代谢过程。ATP和ADP对二价离子有亲合作用，因为它们有负电荷的磷酸集团，Mg2+和Mn2+是与核苷酸组成复合物的两种最常见的离子，因此多数ATP和ADP在细胞内以镁和锰盐的形式存在。另外，涉及PO43-运输的多数代谢反应通常需要Mg2+和Mn2+做为辅助因子，当与PO43-相连时这些离子促进磷的运输，这个过程是通过选择分子的电荷量进行的，因此，反应更加敏感。那些非PO43-集团转移过程中的酶也需要Mg2+做为辅助因子。例如，糖酵解过程中需要的磷酸丙酮酸水合酶，只有与4个Mg2+结合后才具有活性。三羧酸循环中需要的异柠檬酸脱氢酶也需要Mg2+和Mn2+，该酶有两种形式，一种是由Mg2+激活，另一种是被Mn2+激活。Mg2+酶对代谢调控比较敏感，而Mn2+酶对底物有较强的亲合力。因此，Mg2+和Mn2+可以决定该酶的活性，这样有助于调控三羧酸循环的功能。真菌中其它需要Mg2+的重要酶类是DNA聚合酶、几丁质酶、纤维素酶和谷氨酰胺合成酶。 Mg2+能影响细胞膜的结构与功能。在粗糙脉孢菌中，细胞膜上的糖蛋白合成需要Mg2+，而且Mg2+能使蛋白组分聚集在一起而保持膜的稳定性，Mg2+还能增加膜的密度使其通透性降低而抑制运输。在酵母菌中，Mg2+能部分地阻碍K+与H+，K+与K+在基质与细胞间的交换。 因为Mg2+能影响大量的生化过程，因此Mg2+影响生长和发育是不难理解的事情。这也是在培养真菌的培养基内加入镁盐的缘故。 二、磷 大多数的磷是以PO43-的形式存在，以PO43-形式存在的磷是许多重要大分子，如DNA、RNA、磷脂以及小分子如NAD、FAD、焦磷酸硫胺素、维生素B12、CoA等的重要组分。此外，还是核苷酸，如ATP、GTP、CTP和UTP的组分，PO43-在细胞内参与了能量的贮存和转换。 磷酸分子的结构决定了它的许多性质。四个氧原子排列在四面体的四个角上，中间是磷(图4-8A)，这个结构使得四个P-O键平衡，每个单键具有双键的性质，双键具有单键的性质(图4-8B)，这叫做共振现象(resonance)。PO43-是一个共振杂化物，共振使得PO43-低能量，而且比非共振分子更稳定。当PO43-像在ATP中那样连成链后，相邻的PO43-之间互相影响，共振减弱，因此ATP水解物比反应物共振稳定。当pH7.0时，ATP的多磷酸部分有四个距离很近的负电荷(图4-8C)，这些负电荷相互之间排斥力很大，因此，电的排斥和共振的稳定性使得反应物和产物之间有一个大的能量差。使得ATP在细胞的能量供给中起重要作用。(b)(c)(a)图4-8 (A)磷酸分子的四面体结构，(B)P-O键的杂化物性质，(C)ATP的水解 真菌吸收的磷是以PO43-形式吸收，许多真菌向外界环境分泌磷酸酶，该酶使PO43-从磷酸化合物中分离出来。对少数几种真菌的研究中发现PO43-的吸收是主动吸收。在粗糙脉胞菌中有两种吸收方式，一种是组成性的(constitutive)；另一种是通过PO43-饥饿去阻遏的。啤酒酵母也有两个系统，一种是Na+依赖性载体，在运送每个PO43-的同时运送两个Na+；另一种载体是Na+非依赖性的，每个PO43-与两个H+同时运载，这种运输伴随一个K+的外流。PO43-能促进二价离子的运输，如Ca2+、Mg2+等，但一些一价离子的吸收被PO43-抑制。 在细胞内多余的PO43-可以聚合成多聚磷酸的形式存于液胞中。在啤酒酵母中多聚磷酸占细胞干重的35-40%，已证实在液胞中大量的精氨酸与聚磷酸牢固的结合，而且有一些酶系统控制着精氨酸在液胞中的结合以及不断地向细胞质中释放。 如果把PO43-加到磷不足的培养基中，可以促进真菌的生长。在缺磷的培养基中生长的链格孢(Alternaria)，当加入磷酸钙、磷酸钠、磷酸钾和磷酸铵后，生长急聚加快。然而在麦角菌(Claviceps purpurea)中，KH2PO4从125增加到150微克/毫升，结果导致孢子形成率减少50%。因此，磷虽然参与了许多生化反应，但也抑制了另一些反应。多数微生物培养基中，PO43-含量在0.3-300m时生长最好，但这个浓度范围抑制许多代谢物的产生。如指状青霉(P.digitatum)，培养基中PO43-从100mmol/L降至0.1mmol/L，使乙烯产量增加80倍(图4-9)，而且蛋白激酶(是催化蛋白磷酸化的酶)和磷酸酶的活性在PO43-低的培养物中比充足的要高，所以认为乙烯的产生是由磷酸作用和脱磷酸作用调控的。图4-9 指状青霉(P.digitatum)在摇瓶培养生产乙烯时，培养基中磷酸盐含量的效应三、钾 真菌生长需要钾，因为培养基中的痕量污染而常常不容易被证实。K+在真菌中的主要作用是调节渗透压。细胞的渗透压是与培养基中的水是否进入细胞并提供生长所需的膨压相关的，海洋真菌在高氯化钠环境中生长的能力是靠K+的运输来调节渗透压。在高盐中生长的真菌选择性吸收K+而分泌Na+或H+。K+的吸入减低了培养基和细胞质的渗透压的差异，改变了Na+对真菌的抑制作用。K+在细胞内还与蛋白结合，使酶被激活，如醛缩酶、丙酮酸激酶等。Slayman等人1964年发现在无钾培养基中污染的痕量K+含量达到16mol/L，粗糙脉孢菌在这种无K+的培养基和提供K+的培养基中的生长情况，显示在图4-10(A)中。从生长曲线中明显地看出，在污染痕量K+的培养基中生长良好，随K+浓度的升高生长速率明显上升。但在图4-10(B)中可以看出生长速率随着K+浓度的增加而上升，在K+浓度高于10mmol/L后生长受到抑制而开始下降。在上述研究的同时，对胞内K+的研究证实粗糙脉孢菌能大量积累K+。当细胞外K+浓度降低时，胞内K+的降低由Na+来平衡，这说明在K+低时，胞内的K+与胞外的Na+有一个交换。胞内K+大量积累对于有机体的正常功能是重要的。多烯类抗生素，如两性霉素B(amphotericin B)、制假丝酵母素(candicidin)和制霉菌素(nystatin)在处理真菌感染时是有效的，因为它们与细胞膜上的固醇结合，快速的引起细胞内90%的K+漏出胞外，K+的丢失导致多种代谢途径受阻，包括糖的酵解和呼吸。这些抗生素的影响可以通过提高胞外K+来恢复，这样可以降低K+泄漏，或者通过升高胞外Ca2+和Mg2+浓度导致膜损伤阻止K+泄漏。 图4-10(A)在无K+基础培养基中加入 图4-10(B)外部K+浓度培养粗糙脉孢菌 0.45，0.10和0.016mmol/LK+后， (N.crassa)的效应，以15h摇瓶培养 粗糙脉孢菌(N.crassa)的生长曲线 的菌体干重计算四、硫 硫是蛋白和维生素的组成成分，因此有机体需要量较大，氨基酸中甲硫氨酸、胱氨酸等都含有硫。胱氨酸中巯基集团在稳定蛋白结构中起重要作用。两个半胱氨酸通过二硫键连接组成胱氨酸。蛋白质中的二硫键有助于维持折叠构型，影响细胞中蛋白的作用方式。硫还参与辅酶、硫胺素、生物素、辅酶A和硫锌酸的构建。有些酶在活性位点上具有铁和硫的复合物，如假丝酵母的顺乌头酸酶就是铁硫蛋白，如果丢失这些原子该酶即失活。 SO42-是真菌利用硫的最普通形式，对啤酒酵母、粗糙脉胞菌、构巢曲霉、产黄青霉等的研究表明，SO42-是主动运输进入细胞的。而S2-的吸收却没有明显的载体做介质。 SO42-一旦进入细胞，便很快转化成为有机分子而进入蛋白质。把产黄青霉培养在含有35SO42-的培养基中时，培养基中的标记物迅速下降，同时菌丝中有机硫的标记物很快增加，五分钟后菌体蛋白中出现标记物，随着时间的延长标记物数量逐步增加。真菌可以多种形式贮存多余的硫。例如，甲硫氨酸、半胱氨酸，硫同化途径中的高半胱氨酸都能起到贮存的作用。另外，在高等真菌中，胆碱-O-SO42-是主要的贮存形式。真菌利用各种硫的能力不同。例如，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)有一个氧化硫的途径，从SO氧化为SO42-。其氧化形式如下: SO S2O32- S4O62- SO42-因此，这些化合物，包括连二亚硫酸盐、连四硫酸盐都能被利用来做为硫源。在许多低等真菌中，如芽枝霉目(Blastocladiales)的所有成员，不能以SO42-做为硫源，但是能够利用有机硫和无机硫的还原形式。 元素硫(S8)已在大量的真菌类群中被检测到。这种形式的硫是真菌的自身抑制和休眠结构中的主要存在形式，如孢子、厚垣孢子以及菌核。在茎点霉属的一个种Phomopsis viticola 的孢子中，已经证实S8的存在抑制正常条件下孢子的萌发，因为S8从电子传递链中接受电子，可能引起呼吸速率的下降以及孢子休眠期的延长。硫进入蛋白质的过程主要分两个阶段(见图4-11)，第一阶段中SO42-通过与ATP反应初步活化，形成腺苷磷酸硫酸盐(adenosine phosphosulfate，APS)，APS磷酸化释放腺嘌呤，一部分硫被还原成SO32-，最终游离的SO32-还原成S2-。第二阶段是S2-转变成有机硫，形成半胱氨酸和甲硫氨酸(蛋氨酸)。在图4-11中也显示了这两个氨基酸可以从丝氨酸和天冬氨酸形成。尽管硫酸盐的吸收不受SO42-的还原和有机硫形成的支配，但从胞外硫到胞内半胱氨酸和甲硫氨酸的途径都由前体物和终产物两者控制。例如，在粗糙脉孢菌中，胞内高浓度的SO42-或甲硫氨酸都阻遏硫酸盐透性酶的合成。在啤酒酵母中，SO42-、APS、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸控制着透性酶的水平。从SO42-到蛋白的其它合成步骤，在大多数情况下由半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸控制。腺嘌呤-5-磷酸硫酸盐(APS)3-磷酸腺嘌呤-5-磷酸硫酸盐(PAPS)PAPS还原酶SO32-S2-高胱氨酸甲硫氨酸S-腺苷甲硫氨酸胱硫醚半胱氨酸丝氨酸ATPADPdDDPPAPS酶天冬氨酸高丝氨酸D-乙酰高丝氨酸图4-11 硫酸盐同化中涉及的一些途径五、钙 在真菌培养基中一般要加入钙盐，可使许多真菌的生长和繁殖速度加快。每升培养基中加入500毫克的Ca2+可使卡尔酵母(S.carlsbergensis)生长增加3倍(图4-12)。图4-12 CaCl2和培养时间对卡尔酵母(S.carlsbergensis)生长的效应 每毫升500g的CaCl2 对照组 在低等真菌的生长过程中对钙的需求比较明显。例如，草莓疫霉(Phytophthora fragariae)、恶疫霉(P.cactorum)、异丝水霉(Saprolegnia diclina)的培养中，Ca2+能促进孢子囊的形成。腐霉属(Pythium)一些种的卵孢子形成需要钙。对钙的需要量常依生长培养基的成分而定，例如寄生疫霉(P.parasitica)在硝酸盐培养基上生长时绝对需要钙，当L-天冬氨酸做氮源时，Ca2+能刺激生长但不是必需的。在培养绵霉属(Achlya)时钙是形成孢子囊所必需的，而且0.1-1.0mmol/L Ca2+是孢子囊形成的有效浓度。 Ca2+的运输过程即有主动运输又有扩散作用。在绵霉中，Ca2+的吸收呈饱和动力学状态，不受呼吸抑制剂的影响，所以认为Ca2+的吸收是通过扩散进行的。相反，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)吸收Ca2+需要代谢能，并伴有质子同向转移，这一系统对Ca2+有高的亲合性，同时也能运载Sr2+、Mn2+、Co2+和Mg2+。目前认为Ca2+是通过细胞膜向内、外两个方向运输，这种吸收和外渗是循环式的。45Ca2+吸收的循环性是与细胞有丝分裂相关联，在有丝分裂前期和后期吸收积累Ca2+，在中期Ca2+外流(渗)，而吸收上的变化并没有引起胞内Ca2+浓度的大量改变。因为Ca2+能引起动物细胞内微管亚单位的解聚(depolymerization)，因此，认为或许真菌细胞有丝分裂时Ca2+的循环涌入，激发了细胞核周围所贮藏钙的释放，Ca2+通过对微管(纺锤丝)形成的影响来调控有丝分裂。钙也是许多细胞结构的组分。在真菌的孢子囊、配子囊以及接合孢子中都发现有以草酸钙晶体存在的钙，接合孢子中的晶体是与细胞壁紧密结合的，有些时候覆盖在细胞壁上。 六、铁 铁离子对于所有生物有机体来说是必需的，但它的溶解性和生物活性通常都很低，所以在生物进化过程中衍生了特异性吸收铁离子的机制。在真菌中存在着几种不同的铁离子的吸收机制。 铁有许多重要的生化作用，其一是被转运到光卟啉上形成亚铁原卟啉分子，亚铁原卟啉是呼吸链中细胞色素及酶，如过氧化氢酶和过氧化物酶的辅基。其它含铁的酶不是被亚铁原卟啉螯合而是与巯基结合，这些Fe-S蛋白包括琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶和顺乌头酸酶，在许多含铁的酶中，铁在Fe2+和Fe3+之间转换，依此参与电子转移。在葫芦科剌盘孢(Colletotrichum lagenarium)中观察了真菌对铁的生长反应。在不含铁的培养基中与对照的非净化的培养基中生长降低了81%，随着浓度从0.01到10ppm增加，菌丝呈线性生长，当铁达到25ppm时生长受到抑制(图4-14)。表4-7表明，在葫芦科剌盘孢中，在Fe2(SO4)3三价铁的培养基中要比FeSO4的二价铁生长的好，Fe(OH)3是最好的铁源而Fe2O3是较差的铁源。但是对致病疫霉(Phytophthora infestans)的20个菌株Fe2+和Fe3+对生长速率影响的实验表明，Fe2+和Fe3+都能促进生长，但是Fe2+使生长的对数期缩短。其中18株在Fe3+培养基生长菌株通过向培养基中加入抗坏血酸(维生素C)后，菌株呈现快速生长，在不加入抗坏血酸时生长不及Fe2+，这说明Fe2+比Fe3+利用得快，同时也说明抗坏血酸促进生长的机理是将Fe3+还原成Fe2+，因为Fe2+比Fe3+易溶，更易被利用。表4-7 在补加不同铁源的葡萄糖天冬氨酸培养基上葫芦科剌盘孢的生长情况加入的铁化合物铁离子浓度(ppm)菌丝量(