离子淌度质谱IMMS.docx

离子淌度质谱离子淌度质谱是离子淌度分离与质谱联用的一种新型二维质谱分析技术，离子淌度分离原理是基于离子在飘移管中与缓冲气体碰撞时的碰撞截面不同，离子可按大小和形状进行分离。经过30多年的发展，离子淌度质谱已配有多种最新的离子源及质量分析器，理论研究也日渐成熟，并在蛋白质、多肽及复杂化合物异构体分析方面越发显示出独特的优势，正在发展成为一种新型的重要分析工具。20世纪80年代后，由于各种软电离技术相继问世，质谱(mass spectrometry，MS)的应用拓展到对高极性、难挥发和热不稳定的生物大分子的分析研究，发展成为生物质谱，并迅速成为现代分析化学最前沿的领域之一 。离子淌度质谱(ion mobility mass spectrometry，IMMS)是离子淌度光谱(ion mobility spectrometry，IMS)技术与质谱的联用。是一种新型的二维分离质谱技术。IMS技术出现于20世纪70年代，由于其具有多样性的分析能力、良好的检测限及实时的检测能力，在当时受到人们广泛关注，但由于IMS分辨率较低且不能给出离子质量信息，加之当时人们对离子组成的重要性缺乏理解，因此在1976年以后，有关离子淌度的研究逐渐减少。直到20世纪80年代末，特别是以MALDI和ESI 为代表的各种软电离方法应用以来，IMS在化合物异构体分离方面具有的独到优势才又引起了人们的关注，相继推出了配备各种新型离子源的IMSMS联用技术，精确的离子几何形状和淌度计算方法得到飞速发展，IMMS技术有了实质性进展。目前，IMMS已经用来检测化学战剂、爆炸物 、环境污染 、麻醉剂 、半导体及生物大分子(如肽和蛋白质类)，并显示出其强大的分析能力。1 原理与仪器组成11 IMMS基本原理离子淌度(ion mobility，IM)，又称离子迁移率，是指在电场强度为1 Vm或电场力为1N时正离子或负离子的运动速度，单位为m V。在IMS中，离子受电场力加速的作用向前运动，运动中又与飘移区缓冲气体分子发生碰撞产生阻力使速度降低。碰撞过程中离子失去的动能可转化为内能使离子温度升高，再次的碰撞又可将升高的内能传递给气体分子，回复到系统温度 。因此，离子在运动过程中温度和速度并不保持恒定。离子之间、离子与缓冲气体之间也可能存在着静电引力与库仑斥力，决定了离子在飘移区的运动过程是极其复杂的，只能由其平均速度(即离子淌度 )或离子通过飘移区的时间td来计量。这种分离过程与色谱的分离过程类似，因此IMS在早期又被称为等离子体色谱(plasmachromatography，Pc)。为了使不同实验条件下的测量值能够相互比较，在实际应用中通常将离子淌度转换为折合离子淌度(reduced ionmobility， )，即在温度为273 K，压力为760 Tort的条件下的离子淌度，离子的大小和形状可用离子与缓冲气体发生碰撞时的平均可用截面即碰撞截面(collision Cross section，n)来衡量。由上述可知，离子淌度分离主要是基于离子的形状和大小。因此，对于用常规质谱方法不能区分的异构体或复合物等分析，这种分离手段具有独特优势。离子按淌度预分离后，再通过每一组分质荷比求得质量数，便可获得离子淌度质谱二维图谱或三维图谱(图1)。12 仪器组成离子淌度质谱仪与常规质谱仪的主要区别在于前者在离子源和质量分析器之间增加了一个离子飘移管。离子飘移管通常由不导电的高纯度氧化铝制成，中间镶嵌若干不锈钢环，不锈钢环之间以高温电阻相连，两端不锈钢环之间施加驱动离子前进的电场。质量分析器可采用四极质量分析器或飞行时间质量分析器，由于四极分析器扫描离子费时较长，现在IMMS分析器多为飞行时间质谱(TOFMS)。仪器中飘移管部分通以缓冲气体，质量分析器部分采用高真空，二者之间配以由锥体和离子透镜组成的接口。典型的离子淌度质谱的组成见图2。由于离子在飘移管中通过的时间为毫秒级，在飞行管中通过时间为微秒级，在下一组分到来前有充足的时间求得离子的质量数，因此对每一组分可在一次实验中同时求得淌度和质量数，整个实验可在1 min内完成。有时为了获得更多的离子信息，可在飘移管前和(或)后串联使用几种质量分析器，如离子阱或四极滤质器等。2 离子淌度理论的研究进展21 缓冲气体对碰撞截面的影响IMS区分离子是通过与缓冲气体分子碰撞过程而实现的，缓冲气体的种类直接影响分离过程。氮气和氦气是最常用的两种气体，氮气一般用于常规分析，氦气常用于结构分析。其他气体还有二氧化碳、六氟化硫、氨 和四氟化碳 。使用不同缓冲气体的理论研究在1975年之后便很少，即使是现在也还没有引起人们足够的重视，但在实际应用中，使用不同的气体对获得良好的分辨率和检测灵敏度相当重要。离子的碰撞截面不仅与缓冲气体的质量数有关，而且取决于缓冲气体极化率的大小 。Matz等 研究6种苯丙胺(安非他明)衍生物在氦气、氩气、氮气与二氧化碳4种不同缓冲气体下的碰撞截面，结果显示碰撞截面随缓冲气体质量数的上升而上升，但并无严格的线性关系。而极化率与碰撞截面之间有良好的线性关系，碰撞截面随极化率的上升而上升，这也说明碰撞截面更依赖于缓冲气体的极化率而不是质量数。Els等 研究了不同浓度的氮气二氧化碳混合气体作为缓冲气体在l0 水平分离5种氯代和溴代乙酸的情况，使用100 氮气，2种组分淹没在其他峰中，若在缓冲气体中加入3二氧化碳，则能达到完全分离，表明载气的组成明显影响峰形的检出。22 离子淌度与质荷比的关系IMS分辨率较低，即使是高分辨IMS也只能达到与常规HPLC相同或稍高的分辨能力，这使其单独分离复杂混合物变得困难。在IMS发明之初，研究者就试图通过建立 与mz的关系，由 推知离子的质量数。但大量实验数据表明， 与mz之间只是一种粗略的线性趋势，远远不能满足人们对离子质量数的精确要求，IMS在质荷比(mz)IMMS中只能作为一种前质量分析器。尽管有的物质能够通过单一的离子淌度技术快速鉴别开来，但IMMS能够提供的二维“淌度质量”模式能够达到对复杂混合物的高分辨分离。在二维IMMS(2-D IMMS)中，不同电荷的离子其“淌度质量”线性趋势明显不同，通过对复杂产物的2-D数据进行分析，找出其不同的“淌度质量”关系已经成为鉴定和解释这些产物的一种重要技术。Clemmer等已经通过 与mz趋势关系鉴别了低淌度(单电荷)和高淌度(双电荷)的两组肽混合物 J。Russel等使用内标作为参照标准，根据 与mz关系将蛋白质酶解后的肽混合物分开 。Stciner 利用ESIAPIIMTOFMS分析水溶性化学战剂降解产物，使用相同系列的n一烷基胺作为基线标准，利用不同降解产物的与mz趋势使其得到鉴定。离子淌度的测定受各种因素的影响，如电喷雾溶剂组成、飘移区温度、喷雾电压、溶剂流速、缓冲气体流速、冷却气体流速等诸多因素影响。23 离子电荷、取代基与碰撞截面的关系尽管还没有方法证明气相离子和溶液中离子的结构之间有如何紧密的关系，但精确测量离子的碰撞截面还是能提高对肽、蛋白质等复杂物质结构的理解。离子中原子间氢键和范德华力使其呈现折叠和紧凑状态，电荷和库仑斥力则克服离子内的相互吸引而使分子呈现松散状态。Kindy等利用同位素标记研究了3种蛋白质的酶解产物，发现单乙酰化肽段的碰撞截面比未乙酰化的要高出25 35 ；双乙酰化的增加更多，这种增加(特别对大的肽段)远远大于乙酰基的体积增大因素，表明乙酰基具有对肽离子整体结构改变的特殊作用。Badman等 叫研究了泛素从ESI进入IM管过程中碰撞截面的变化过程，认为离子进入飘移管的初期均为紧凑结构，受加速电压的作用才快速伸展成开放结构。离子中电荷的位置和数量是影响气相离子碰撞截面的重要参数。Wu等 研究了强啡肽A的3个片段F7(TyrGlyGlyPheLeuArgArg)、F8(TyrGlyGlyPheLeuArgArg一e)、F、9(TyrGlyGlyPheLeuArgArgHeArg)带13个电荷时的碰撞截面变化情况，结果见表1。单电荷和双电荷的碰撞截面从F7至F、9增加值稳定在约9 ，这可用在C端增加一个氨基酸的“大小效果”很好地解释。另外，所有3种肽从单电荷到双电荷碰撞截面的增加都保持在相似的7 一8水平。随着电荷的增加，库仑斥力增加使肽呈现更松散状态。然而，在F7和F8中引入第3个电荷，却使碰撞截面急剧上升，这是因为在这些肽中只存在3个碱性位点，相邻的两个精氨酸残基必须同时质子化，急剧增加的库仑斥力能使得离子以一种更加伸展的状态存在，而使碰撞截面急剧增加。F、9离子增加不显著是因为末端精氨酸残基的存在可以避免两个相邻氨基酸均被质子化。Badman等 总结了19962001年间发表的细胞色素e气态离子碰撞截面的数据，所带电荷从+3至+20，虽然同电荷离子的碰撞截面数值稍有不同，但均表现为随电荷的增加而增加，增加幅度也极为相似。利用碰撞截面最具优越性的地方在于区别具有相同电荷、相似质量的不同离子或质量数相同的异构体离子。Henderson等 研究了细胞色素c两个酶解碎片IFVQKCAQCHTVEK(相对分子质量为1 633820)和hemeCAQCHTVEK(相对分子质量为1 633615)，二者具有极为相似的质量数，在序列已知的情况下，利用软件模拟其电荷分布情况，分别计算其所需的碰撞截面和加速电压，测量其离子淌度，求出碰撞截面并与计算值相比较，从而区分两种碎片，结果显示两个碎片均带两个电荷，分别为I rVQKCAQCHTVEK 和hemeC“AQCHTVEK (上标为质子化位置)。文献35列出了34种常见蛋白质酶解后的660种肽离子的碰撞截面数据，并从统计学角度在理论上分析了氨基酸残基的内在形状参数与碰撞截面的关系，从而可通过氨基酸序列预测肽离子的碰撞截面。文献36也有类似报道。3 展望质谱技术是当今分析化学领域最重要的技术之一。离子淌度质谱结合了离子淌度技术灵敏、快速、能够提供离子结构信息和质谱能够提供准确质量信息的特点，在化合物异构体分析、生物大分子相互作用分析等方面正显示出越来越多的