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DNA损伤修复过程中H2AX磷酸化的调控及其意义陈丽萍/朱小年(综述)/陈 雯*(审校)( 中山大学公共卫生学院预防医学系, 广东 广州 510080 )【摘要】 组蛋白2A变异体(histone family 2A variant，H2AX)在DNA双链断裂(double-strand break, DSB)损伤时可以发生不同的翻译后修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。通过这些修饰，H2AX标记损伤的DNA双链，促进局部DNA修复因子和染色体重塑因子的募集，维持基因组的稳定性。这对于DSB的有效修复及细胞周期从周期检查点的恢复都是十分必要的。另外，H2AX在DSB信号通路必不可少的作用及其在肿瘤发生早期被激活事件，使它成为肿瘤生物学研究中的热点基因蛋白。本文中重点阐述近几年H2AX在DSB损伤修复中的研究进展，同时提出将它作为一个表观遗传标记，在人类肿瘤的早期诊断和治疗中的潜在应用价值。【关键词】 H2AX磷酸化; DNA损伤反应; 单倍剂量不足中图分类号： R730.231 文献标识码： A 文章编号： 1004-616X(2011)02-0148-04 doi: 10.3969/j.issn.1004-616x.2011.02.016组蛋白2A变异体(histone family 2A variant，H2AX)是核心组蛋白H2A的一个亚型，最早于1980年由West和Bonner首先报道1。和其他H2A家族成员一样，H2AX的残基末端也能发生甲基化、乙酰化和磷酸化修饰。H2AX的独特之处在于羟基末端由4个氨基酸SQ(E、D)(I、L、F、Y)组成的高度保守序列，称为SQE基序2。当细胞发生DNA损伤时，SQE迅速发生磷酸化，产生-H2AX。H2AX是最早被磷酸化的底物，在电离辐射12 min可以出现，30 min达到最高，是细胞中感应DNA损伤最敏感的分子。-H2AX焦点的数量和大小可以通过免疫荧光或细胞流式技术检测得到，且数量和大小与一定范围的损伤剂量相关。所以，越来越多的研究提出-H2AX是DNA损伤的一个很好的蛋白标记物3-4。-H2AX不仅参与DNA双链断裂(double-strand break, DSB)的识别和修复，还与P53相互作用，激活细胞周期检查点，阻滞细胞周期，为DNA损伤修复赢得时间，保证遗传信息的正确。所以-H2AX可作为基因组的“监视器”，当修复不能完成时，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡。研究发现H2AX 敲除的小鼠表现对电离辐射敏感性和肿瘤易感性增加5，可能是因为H2AX的缺失，不能有效修复DNA损伤，最终导致基因组不稳定。这提示H2AX在维持基因组稳定性过程中起重要作用。本文将重点综述H2AX在募集DSB修复因子、染色质重塑复合物和cohesin复合物到DNA损伤位点进行修复，及在哺乳动物中-H2AX移除机制的研究进展，并阐述H2AX作为一个表观遗传的生物标志物在人类肿瘤研究中的应用。1 组蛋白H2AX调控DNA双链断裂的修复过程1.1 组蛋白H2AX磷酸化外源因素如电离辐射、紫外线及化学物喜树碱、博来霉素和羟基脲，内源性包括正常代谢产生的ROS、细胞的衰老和凋亡、DNA修复缺陷、V(D)J重排和减数分裂都会引起DSB，伴随H2AX的磷酸化和聚集。真核生物中，H2AX的磷酸化由PIKKs家族，包括ATM(ataxia telangiectasia mutated)、ATR(ATM and Rad3-related protein)和DNA-PKs(DNA-dependent protein kinase)介导6。ATM主要介导DSB形成时H2AX的磷酸化，ATR主要在单链损伤和复制损伤中起作用，DNA-PKs则介导细胞凋亡过程中产生DNA碎片时的H2AX磷酸化，而所有激酶都可能参与电离辐射引起的DNA损伤。-H2AX可通过Western blotting检测或应用免疫荧光技术，在荧光显微镜下可清楚观察到以-H2AX焦点形成为特征的DNA双链断裂的区域，且1个-H2AX焦点对应1个DSB7。在哺乳动物细胞中，每产生1个DSB约有0.03的H2AX磷酸化，相当于H2AX随机分布于2 Mb 染色质区域，而免疫细胞化学分析表明这一区域比实际形成点的区域大10倍，说明并不是每一邻近的H2AX分子均会发生磷酸化7。4Pi显微镜观察到H2AX并不是随机分布的，而是成簇分布在基因组中8。那么，在没有组蛋白H2AX分布的区域DNA损伤反应是如何发生的仍不清楚，且H2AX和某些损伤相关因子的分布不同，是否可以用来解释一些区域对DNA损伤易感而一些区域耐受？这需要进一步的研究来回答。1.2 损伤修复因子的募集DSB诱导H2AX的磷酸化主要通过ATM激酶介导。感应到损伤后，ATM Ser1981发生自动磷酸化而激活，与PP2A复合物分离。三聚复合物MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)首先识别DNA损伤，然后募集活化的ATM到损伤位点，使ATM靶向下游底物，如H2AX、BRCA1、53BP1(p53-binding protein 1)和MDC1(DNA damage checkpoint protein 1)，磷酸化周期蛋白CHK1和CHK2，激活周期检查点9。H2AX Ser139的磷酸化作为DNA损伤起始信号，募集修复相关蛋白和周期蛋白到损伤位点，与-H2AX结合形成焦点。如在电离辐射作用下，MRN复合物、Rda51和-H2AX共定位的核内位点称为IRIF10。MDC1通过BRCT结构域直接与-H2AX结合，并锚定ATM以募集更多活化的ATM，放大H2AX磷酸化信号，同时保护-H2AX不被去磷酸化11。NBS1与-H2AX的结合促使越来越多的DDR(DNA damage response)蛋白包括BRCA1、53BP1和MRN复合物在损伤位点的聚集。MCPH1与染色质凝聚和细胞周期相关，它的募集依赖于-H2AX12。在DSB位点，MCPH1与周期相关蛋白BRCA1、 NBS1、CHK1、 53BP1、MDC1、ATR、RPA (replication protein A)、ATM等结合，这解释了-H2AX在周期检查点的重要作用。真核细胞中主要通过两种途径修复DSB，即非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)和同源重组(homologous recombination, HR)，HR主要发生在S期和G2期，而NHEJ发生在整个细胞周期13。修复方式不同，参与的修复蛋白也不同。在HR中，-H2AX还募集cohesin复合物，促进姐妹染色体之间的物理连接。在哺乳动物细胞中，H2AX调控姐妹染色单体的重组，促进染色体内部在SSA通路中无错误的同源重组。1.3 -H2AX募集染色质重塑因子在DNA损伤修复过程中，-H2AX募集染色质重塑修饰因子到损伤位点。Downs等14发现在体外-H2AX和NuA-4复合物(H4特异的乙酰转移酶复合物)相互作用，且通过NuA-4的一个亚基，Arp4蛋白和ATP依赖的染色质重塑复合物INO80和SWR1介导。Arp4可以使组蛋白H4乙酰化，使包含DNA损伤处的染色质打开以促进DNA修复。INO80和SWR1重塑复合物的作用区别主要在前者移除组蛋白以促进DNA修复和检查点的激活，而后者主要参与修复过程和检查点的恢复。染色质重塑使DNA更加接近参与DSB修复的酶如HR和NHEJ的末端修复酶13。另外，DNA损伤诱导染色质重塑促进磷酸化H2AX的交换。已经发现H2AX能比较缓慢的在染色质中扩散15。最近也发现在DSB出现后，TIP60组蛋白乙酰化酶结合到H2AX上，催化H2AX 的K5和K119同时发生乙酰化，并从核小体上被移除16。这可能是因为，组蛋白虽是不可移动的，但经乙酰化、泛素化修饰后，与核小体的亲和力降低而被释放出来。体外实验也发现FACT介导H2AX交换过程，并受H2AX磷酸化和核糖化修饰的调节，支持了H2AX可能参与核小体结构重塑的观点17。总之，组蛋白H2AX和-H2AX在修复过程中呈动态变化，其促进DNA损伤修复和染色质重塑。1.4 损伤修复中的“crosstalk”H2AX磷酸化是DSB反应的中心元件，其功能是稳定DSB并为修复蛋白提供结合位点，在DSB修复中极其重要。除了磷酸化，泛素化、乙酰化和甲基化也作为损伤后修饰出现在DNA损伤依赖的信号通路中，各种组蛋白修饰形成一个“crosstalk”18， 也是DNA损伤反应的一种重要机制。H2AX的磷酸化是最早发生的事件，它能促进组蛋白H2A和H2B泛素化，重塑染色体促进以募集更多修复蛋白到DSB位点，如RAP80和BRCA1的累积。在DNA损伤时，H3也会发生K9/K14/K18/K23和K27的乙酰化修饰，中和了组蛋白正电荷，减少组蛋白和DNA的亲和力，使染色质结构疏松。H2AX的乙酰化通过Tip60介导也促进其泛素化16，这些事件都促进不同的DNA修复蛋白募集到DNA损伤位点。H3的乙酰化是染色质重塑复合物SWI/SNF结合到含有-H2AX的核小体所必需的修饰，H2AX的磷酸化促进了H3的乙酰化，当H2AX Ser139发生突变时，组蛋白乙酰化修饰减少，且H3的乙酰化又会促进H2AX的磷酸化19。各种修饰的交互对话使DNA损伤信号迅速放大，募集修复相关因子进行修复。1.5 -H2AX焦点的移除修复结束后，-H2AX焦点逐渐消失，其机制尚不清楚。目前认为可能有两个机制：通过未磷酸化的H2AX或H2A来置换核小体中的-H2AX。DNA损伤诱导染色质重塑会促进磷酸化的H2AX的交换。在果蝇中，染色质重塑复合物Tip60特异地使组蛋白H2Az乙酰化，并和一些无修饰的H2Az交换，这个过程由Tip60和ATPase介导20。在哺乳动物细胞中，Siino等15观察到带GFP标签的组蛋白在染色质中缓慢移动，但34 h后，约50%带标签的组蛋白被交换21。最近的体外实验也表明H2AX与H2A的交换是由FACT由Spt16和SSRP1组成的二聚体酶介导的，并通过H2AX的磷酸化和Spt16的ADP核糖化来调节17。这些都提供了-H2AX焦点通过组蛋白交换来移除的证据。蛋白磷酸酶使-H2AX去磷酸化。在酵母中，-H2AX的同源物首先从染色体被移除，接着在组蛋白H2A磷酸酶复合物(HTP-C)上去磷酸化，其中一个亚基是Pph3，与PP2A 60%同源，且-H2AX从染色体释放之后，去磷酸化立即被活化22。研究发现PP2C亚基也可能介导-H2AX的去磷酸化，并作为储存H2A-H2B或者是H2AX-H2B二聚体的分子伴侣23。最近研究认为蛋白磷酸酶能靶向-H2AX，并使其去磷酸化24- 25。Chowdhury等24发现在人类细胞株的DSB修复中，PP2A参与移除-H2AX焦点。通过进一步的CoIP观察到PP2Ac亚基直接与-H2AX结合。将C亚基干扰之后-H2AX焦点持续存在，导致修复无效或者修复不完全，对DNA损伤更加敏感。此外PP4、PP6复合物也参与了DNA损伤时产生的-H2AX的去磷酸过程26-28，并认为不同蛋白磷酸酶可能负责去磷酸化不同来源DNA损伤诱导的-H2AX。alpha4蛋白干扰后也会导致H2AX的持续磷酸化，使修复不能完成，细胞生长阻滞或死亡29。最新研究发现在电离辐射和紫外线作用下，野生型P53介导的磷酸酶1(WIP1)也可以使-H2AX去磷酸化30，WIP1的抑制损害DSB的修复。然而，去磷酸化是发生在核小体上还是从核小体移除之后尚不清楚，也不清楚参与去磷酸化的PP2A全酶的具体组合。针对不同损伤，蛋白磷酸酶如何分工合作及其作用的模式，是将来研究的方向之一。 2 H2AX与肿瘤发生发展的关系及其临床应用2.1 H2AX与肿瘤人类H2AX基因(H2AFX)位于11号染色体11q23，这个区域的普遍缺失或易位出现在很多人类肿瘤中，如血液性恶性疾病和实体肿瘤。目前已经报道了很多DDR(DNA damage response)基因如ATM、MRE11A、CHEK1和H2AFX在人类肿瘤中存在突变和缺失，通过单倍剂量不足(haploinsufficiency)导致肿瘤的发生31。Alt32报道了H2AX和ATM的双敲除对于胚胎是致死性的，然而双缺失的小鼠也表现出严重的生长迟缓和基因组不稳定。这表明DDR基因的突变或者缺失共同作用促进肿瘤的进展。Bassing等5将小鼠的H2AX基因敲除后，小鼠表现出对射线敏感、生长迟缓、免疫缺陷和雄性不育，这可能与基因组不稳定，修复缺陷和不能募集修复蛋白NBS1、53BP1和BRCA1到IRIFs进行修复相关。H2AX基因缺失的细胞株对药物的敏感性增加33，损害了基因组的完整性。当在胚鼠纤维细胞中重建H2AX等位基因可以逆转基因不稳定性和放射敏感性。这表明可以通过H2AX单倍剂量不足的机制来抑制肿瘤，它要求两个等位基因的功能正常。在头颈部肿瘤中，Parikh31发现H2AFX的11q23区域部分缺失，表明H2AFX与人类肿瘤有关。另外，一些远离H2AFX 基因的启动子区域的SNPs与乳腺癌和白血病的发病相关34-35。研究还发现-H2AX出现在人类一些癌前病变的损伤中，伴随其他DDR信号的激活包括CHK2磷酸化，P53的积累和53BP1焦点形成。这表明DSB检查点是癌变的早期阶段抗肿瘤的障碍。另外，在消化道肿瘤细胞株中，使用一种临床药物蛋白激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼处理，可以诱导细胞凋亡，其机制是H2AX的上调36。这些研究都提供了H2AFX抑制人类肿瘤作用的可靠证据37。2.2 H2AX的临床运用目前，H2AX磷酸化已经应用到有效的放射和介入治疗中38。由于-H2AX参与DNA损伤修复，因此可通过抑制H2AX的上游激酶阻止H2AX被磷酸化，或应用潜在的电离辐射增敏剂，使-H2AX持续存在，DNA损伤不能完全修复，促进放射抵抗肿瘤细胞对放射和化疗的敏感性39，从而提高肿瘤放疗的有效性。同时，-H2AX广泛运用作为细胞放射敏感性的指标，我们可根据放疗后-H2AX的数量对照射剂量进行调整，针对不同的患者给以个体化的照射剂量。通过对-H2AX表达的检测，可以给预后评估提供参考40。越来越多研究认为-H2AX水平的升高作为活化DDR是癌前病变、肿瘤组织和培养的肿瘤细胞的一个共同特征34-35。已经证实了一些致癌基因的活化是由一些内源或者环境致突变剂导致的复制压力和DNA损伤，激活DDR的级联反应41。所以，组织中的-H2AX水平可以反映出机体的基因组稳定性，因此可以监测癌前病变，以进行早期治疗，且通过-H2AX水平检测还可以进行肿瘤分期，预后评估监测肿瘤疗效及寻找新的抗肿瘤药物。3 结 语H2AX磷酸化参与机体细胞生理或病理的过程，除了在DNA损伤修复中发挥着很重要的作用，也是VDJ重排，精子减数分裂和性小体失活过程中必不可少的。在DSB信号通路中，H2AX的磷酸化修饰促进了修复蛋白和周期蛋白募集到损伤位点，以及H2AX在该信号通路中的动态调控、修饰及移除，对修复后核小体的重塑，对其它组蛋白修饰的影响，与表观遗传模式之间的相互调控等，相关机制的揭示都有助于我们对H2AX这个蛋白修饰的功能进行更深入的了解。研究证据还表明H2AFX可以作为一个单倍体不足的肿瘤抑制基因，其缺失形成基因组的不稳定，促进肿瘤的发生和进展，其与肿瘤的这种关系可以应用于肿瘤的治疗，潜在应用价值很大。参考文献1 West MH, Bonner WM. 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