人参皂甙单体Rh2诱导髓性白血病细胞株凋亡的时效与量效.doc

人参皂甙单体Rh2诱导髓性白血病细胞株凋亡的时效与量效 侯毅鞠，袁忠海，田 晶，郭素红，李 艳吉林医药学院临床检验教研室，吉林省吉林市作者简介：侯毅鞠，女，1974 年生，吉林省吉林市人，汉族，2004 年解放军第四军医大学毕业，硕士，讲师，主要从事血液学检验及临床基础检验教学方面的研究。出处：Effe中国组织工程研究与临床康复 第12 卷 第12 期 20080318 出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 18, 2008 Vol.12, No.12ct of ginsenoside-Rh2 on the apoptosis in myeloid leukemia cell strain: Dose- and time-dependentmannersAbstractAIM: It is found that some active priciples of ginseng can enhance and activate body immune system, and have many bioactivities such as anti-tumor, anti-aging and anti-radiation. This study examined the effect of ginsenoside-Rh2 (GS-Rh2) on proliferation and apoptosis in human myeloid leukemia cell strain HL60, and analyzed the dose- and time-dependent manners of GS-Rh2.METHODS: Experiments were performed at the Department of Clinical Laboratory of Jilin Medical College from July to August in 2006. Rh2 was purchased from Hongjiu Biotech Co., Ltd. (batch number 050801), and prepared into 50 g/L stock solution by dissolving in pH 7.4 phosphate buffer saline. The HL60 cell strain was purchased from Shanghai Institute of Cell Biology of Chinese Academy of Sciences. HL60 cells in logarithmic growth phase were inoculated into 3108 L-1 cell suspension. After the cells were cultured for 6 hours, 100 L GS-Rh2 at different concentrations (5，10，20，40，80 mg/L) was added respectively. After the cellswere administrated for 48 hours, cell inhibition ratio (IR) was evaluated by MTT colorimetric assay. The 50% inhibitory concentration(IC50) was worked out. HL60 cell was acted with this concentration for different time (6, 12, 24, 48 and 72 hours), cell inhibition ratio(IR) at different time points was evaluated by MTT colorimetric assay, and compare it to the control. After the IC50 of GS-Rh2 actedfor 48 hours, HL60 cells were observed with an inverted microscope. HL60 cell was stained by Giemsa, and the typical apoptosis cellswere discovered.RESULTS: Dose-effect relationship: When the concentration of GS-Rh2 was 5，10，20，40 mg/L, the IR of GS-Rh2 to the growthof HL60 cells was increased gradually in obviously dose-dependent manner. The IR was similar between 80 mg/L and 40 mg/L. Afterthe cells were administrated for 48 hours, the IC50 value was 13.0 mg/L. Time-effect relationship: After the concentration of IC50of GS-Rh2 (13.0 mg/L) acting on HL60 line at different time points (6, 12, 24, 48 and 72 hours), cell IR was increased gradually(F=9.32，P 0. 01) in obviously time-dependent manner. Compared to the control, the density of HL60 cells dealt with theGS-Rh2 (13.0 mg/L) was low and the cells separated from each other with reduced volume. After the cells dealt with GS-Rh2 of13.0 mg/L, the typical apoptosis cells were discovered: showing disorganized, highly contracted and vacuolated, condensed cytoplasm,vanished karyotheca, ruptured cell nucleus and apoptotic body.CONCLUSION: GS-Rh2 can inhibit the growth and induce the apoptosis of HL60 cell line cultured in vitro in a time-anddose-dependent manner.摘要目的：已发现人参中某些有效组分能增强和激活机体免疫系统，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用。选取人髓性白血病细胞株HL60 为模型，探讨人参皂甙单体Rh2 抑制其增殖和诱导凋亡的时效量效关系。方法：实验于2006-07/08 在吉林医药学院临床检验实验室进行。材料：人参皂甙单体Rh2 购自吉林省宏久生物科技股份有限公司，批号050801，溶于pH 7.4 磷酸盐缓冲液中配成50 g/L 母液。人髓性白血病细胞株HL60 购自中国科学院上海生物细胞研究所。实验方法：取处于对数生长期的HL60 细胞制备3108 L-1 细胞悬液，接种后6 h 分别加入终浓度为5，10，20，40，80 mg/L 的人参皂甙单体Rh2 100 L，于加药48 h 后采用MTT 比色法检测人参皂甙单体Rh2 对HL60 细胞生长的抑制作用，计算抑制率和半数抑制浓度。选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2 处理HL60 细胞，分别于作用6，12，24，48，72 h 后采用MTT 比色法测定抑制率，并与未加药对照组进行比较。半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2 作用48 h 时倒置显微镜下观察HL60 细胞形态，吉姆萨染色观察细胞凋亡情况。结果：量效关系：人参皂甙单体Rh2 浓度为5，10，20，40 mg/L 时，处理48 h 后HL60 细胞生长抑制率呈升高趋势（F=9.45，P 0.01），具有明显的剂量依赖性；至80 mg/L 时抑制率与40 mg/L 基本相似。加药48 h 后半数抑制浓度为13.0 mg/L。时效关系：13.0 mg/L 人参皂甙单体Rh2 处理HL60 细胞6，12，24，48，72 h 后，抑制率逐渐升高（F=9.32，P 0. 01），呈时间依赖性。HL60 细胞形态观察：与未加药对照组比较，经13.0 mg/L 人参皂甙单体Rh2 处理后HL60 细胞数量明显减少，细胞分散，体积缩小，细胞核呈碎片状。凋亡细胞吉姆萨染色检测：经13.0 mg/L 人参皂甙单体Rh2 处理后，HL60细胞出现核染色质浓缩、呈周边凝聚，核膜裂解形成凋亡小体、胞质出现空泡但胞膜完整的典型细胞凋亡形态学改变。结论：人参皂甙单体Rh2 能有效抑制体外培养HL60 细胞的增殖，并诱导其凋亡，干预效果呈时间和剂量依赖。关键词：人参皂甙-Rh2；HL60 细胞；增殖；凋亡；细胞工程中图分类号: R394.2文献标识码: A本文导读：创新要点：人参皂甙单体Rh2 对肿瘤细胞增殖和凋亡诱导作用的文献报道多涉及消化、呼吸、神经系统肿瘤细胞、K562 细胞等，检索国内外相关文献，尚未见到人参皂甙单体Rh2 诱导HL-60 细胞凋亡的量效时效分析。偏倚或不足：实验结果表明人参皂甙单体Rh2对HL-60 细胞有明确的增殖抑制作用，且抑制强度呈明显的剂量和时间依赖性。但人参皂甙单体Rh2 对HL-60 细胞抑制率与药物剂量及作用时间的相关性、有效作用浓度范围和作用时间范围等问题未做具体分析，后续试验将予以完善。术语解析：人参皂甙单体是人参的主要功效成分，具有人参粗制剂的全部生理活性，是人参的精华，迄今已确定结构的至少在30 种以上。命名为Ro、Ral、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、I、K、O-glaco 的单体皆由甙元和糖组成，除Ro 的甙元是齐墩果酸外，其他均为原人参二醇和原人参三醇。0 引言 随着医学的发展，对中草药的研究采取了现代化手段，发现人参的某些有效组分能增强和激活机体免疫系统，具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用1。尤其值得关注的是，近年来国内外学者对人参皂甙单体Rh2的抗肿瘤药理学研究日趋活跃。大量体外实验研究表明人参皂甙单体Rh2对人体各种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用2-4，其中能够明显抑制人髓性白血病细胞株增殖并促进再分化，使HL60细胞向不同方向分化逆转为非癌细胞5-7。本实验就是以人类急性早幼粒细胞性白血病细胞株HL60细胞为模型，针对人参皂甙单体Rh2对HL60细胞增殖和凋亡诱导作用进行时效和量效分析， 为进一步阐明人参皂甙单体抗白血病作用机制及其用于白血病的临床治疗提供更多的实验依据。1 材料和方法设计：随机对照细胞观察。单位：吉林医药学院临床检验教研室。材料：实验于2006-07/08在吉林医药学院临床检验验室进行。药物与细胞：人参皂甙单体Rh2（购自吉林省宏久生物科技股份有限公司，批号050801）溶于pH 7.4磷酸盐缓冲液中配成50 g/L母液，超滤除菌，-20 保存；人髓性白血病细胞株HL60购自中国科学院上海生物细胞研究所。试剂与仪器：RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；超净工作台（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；CO2培养箱（上海易亮医疗器械有限公司）；24孔细胞培养板（广州展晨生物科技有限公司）；倒置显微镜；酶联免疫检测仪。设计、实施、评估者：设计为第一作者，干预实施为第一、二作者，评估为第三、四作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。方法：细胞体外培养：将HL60细胞置于含体积分数为0.1小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37 、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养。细胞呈悬浮生长，达80%左右传代。药物处理模式：细胞传代后，接种于96孔培养板内，加入含有不同浓度的人参皂甙单体Rh2培养液，培养至预定时间后进行观测。对细胞生长的抑制作用-量效曲线：取对数生长期HL60细胞制备细胞悬液，浓度为3108 L-1，接种于96孔培养板，100 L/孔，6 h后分别加入终浓度为5，10，20，40，80 mg/L的人参皂甙单体Rh2（分子量622.88）100 L，每一浓度均设9孔，同时设有对照孔和调零孔，各孔总体积均为200 L。在加药48 h后采用MTT比色法检测人参皂甙单体Rh2对HL60细胞生长的抑制作用，并计算每种人参皂甙单体Rh2浓度的平均抑制率。用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测定各孔吸光度(A)值，按下列公式计算抑制率(IR)：抑制率(%)=(1-给药孔平均A值/对照孔平均A值)100%。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线，由此计算出半数抑制浓度（IC50）值。对细胞生长的抑制作用-时效曲线：选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞，分别于作用6，12，24，48，72 h后采用MTT比色法测定抑制率，并绘制时间-抑制率曲线。细胞形态学观察：选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞，48 h后在倒置显微镜下观察实验组HL60细胞形态，与未加药对照组细胞进行对比并拍照。 凋亡细胞吉姆萨染色检测：选择半数抑制浓度的人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞，48 h后离心收集，磷酸盐缓冲液洗涤2次，涂片，丙酮固定10 min，吉姆萨染液Geimsa母液：sorensen缓冲液（pH=7.2）为19染色后，光镜下观察凋亡细胞形态，与未加药对照组细胞进行对比并拍照。主要观察指标：量效关系。时效关系。HL60细胞形态观察。细胞凋亡。统计学方法：由第一作者采用SPSS 11.0软件包进行统计处理，数据用x_s表示，计量资料行方差分析，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果2.1 人参皂甙单体Rh2诱导HL60细胞凋亡的量效关系人参皂甙单体Rh2处理48 h后，HL60细胞生长受到明显抑制，在测定浓度范围内抑制率随药物浓度增加呈升高趋势。人参皂甙单体Rh2浓度为020 mg/L时，各组抑制率差异有显著性意义（P 0.01）；浓度增加到40 mg/L时，抑制率升高程度减小（P 0.01）；浓度增加到80 mg/L时，其抑制率与40 mg/L基本相似。根据曲线得药物作用48 h后半数抑制浓度接近13.0 mg/L。2.2 人参皂甙单体Rh2诱导HL60细胞凋亡的时效关系采用半数抑制浓度13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理HL60细胞6，12，24，48，72 h后，抑制率逐渐增高，呈时间依赖性.2.3 HL60细胞形态观察 倒置显微镜下，未加药对照组HL60细胞数量多，密度大，细胞体积大，呈圆形，折光性强，胞浆内少有颗粒；经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后HL60细胞数量明显减少，细胞间比较分散，细胞形态不规则，体积缩小，胞浆量减少，胞浆颗粒增多，细胞折光性明显减低，生长状态较差。见图1。a: Control group without drugb: Experimental group with13.0 mg/L ginsenoside-Rh2Figure 1 Morphological changes in HL60 cells（400）图1 HL60 细胞形态学变化（400）2.4 凋亡细胞吉姆萨染色观察 HL60细胞经13.0 mg/L人参皂甙单体Rh2处理后常规吉姆萨染色，光镜下可见部分细胞变长，膜鼓起并逐渐脱离细胞，细胞核固缩呈凝块状，并沿核膜边缘聚集，碎裂呈大小不等的圆滴状小体，形成凋亡小体。而未加药对照组细胞大小均一，形态正常。见图2。a: Control group without drugb: Experimental group with13.0 mg/L ginsenoside-Rh2Figure 2 Morphological changes in HL60 cells after apoptosis（Giemsa，400）图2 HL60 细胞凋亡形态学变化（吉姆萨染色,400）3 讨论人参作为中国传统中药，在中药史上占有重要的地位，现代医学研究证实人参皂甙是人参中主要的有效成分，迄今已分离出40多种单体，其中人参皂甙单体Rh2是从人参中提取的天然活性成分，属于十二醇皂甙，大量实验研究表明：人参皂甙单体Rh2对于正常细胞毒性甚低，但却可以通过诱导分化或凋亡，抑制多种肿瘤细胞的增殖和生长8-11。 目前治疗白血病的主要手段仍是采用传统的大剂量联合化疗。肿瘤化疗的目的在于通过化疗药物杀伤肿瘤细胞，促进肿瘤细胞的死亡或阻止其增殖。但绝大多数药物缺乏特异性，会造成正常细胞的死亡，损害机体免疫功能，甚至导致全身性中毒等副作用12-13。因此迫切需要寻找新的方法弥补和完善传统治疗的不足。因此，人参皂甙单体Rh2在抗肿瘤的治疗中受到越来越多的关注和重视14。本实验以人类急性早幼粒细胞性白血病细胞株HL60细胞为模型， 针对人参皂甙单体Rh2 对HL60细胞增殖和凋亡诱导作用进行时-量-效分析，为进一步阐明人参皂甙单体抗白血病作用的机制及其应用于白血病的临床治疗提供更多的实验依据。结果显示人参皂甙单体Rh2对HL-60细胞有明确的增殖抑制作用，其抑制强度与药物剂量和作用时间相关，具有明显的剂量和时间赖性。人参皂甙单体Rh2对HL60细胞的半数抑制浓度接近13.0 mg/L。在本试验中随着人参皂甙单体Rh2浓度的增加，HL60抑制率呈升高趋势，存活率逐渐下降；随着人参皂甙单体Rh2作用时间的延长，抑制率亦逐渐升高，并且各时间组与6h组相比均具显著性差异（P 0.01）。同时形态学观察结果提示HL-60细胞经人参皂甙单体Rh2作用后，在倒置显微镜下可呈现出明显的凋亡形态：细胞缩小、彼此分散、核碎裂成小块、胞浆浓缩。经吉姆萨染色后，光镜下可见部分HL60细胞变长，膜鼓起并逐渐脱离细胞，细胞核固缩呈凝块状，并沿核膜边缘聚集，碎裂呈大小不等的圆滴状小体，形成凋亡小体。而对照细胞大小均一，形态正常，进一步从细胞形态学角度验证了人参皂甙单体Rh2可以诱导髓性白血病细胞株凋亡。细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的，与细胞周期阻滞有关15-17。人参中含有多种具有抗肿瘤作用的皂甙，它们能诱导细胞凋亡及引起细胞周期阻滞，从而抑制肿瘤生长18。已有研究表明，人参皂甙单体Rh2是通过激活caspase-1和caspase-3及上调基因Bax而诱导人神经母细胞瘤凋亡的作用19；阻滞人肺腺癌细胞A549于G1期并诱导其凋亡20。本实验结果表明，在一定浓度范围内，凋亡细胞所占比例呈现出随人参皂甙单体Rh2浓度增加及作用时间延长而递增的趋势。但40 mg/L组与80 mg/L组凋亡率相近，说明人参皂甙单体Rh2达一定浓度后，HL60细胞的凋亡率不再随药物浓度的增加而进一步增加。这可能是由于细胞凋亡是一种在严格的程序性控制下发生的细胞死亡形式，外界刺激通过信号传递系统到达细胞内是启动凋亡的必要条件，随后在一定的内部程序控制下即通过细胞的中央调控使细胞出现凋亡的形态学改变，当人参皂甙单体Rh2的浓度达一定值后，凋亡率不再随药物浓度增加而增加，但具体诱导机制还有待于进一步分析。4 参考文献1 Shibata S. 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