副溶血弧菌噬菌体用于生物防治的初步研究.doc

副溶血弧菌噬菌体用于生物防治的初步研究收稿日期：作者：蔺红苹（1979），女，硕士，主要研究方向为水产经济动物病害及微生物学研究通讯作者：蔺红苹（1979），女，硕士，主要研究方向为水产经济动物病害及微生物学研究Tell,Email:蔺红苹1 邱德全2 谭龙艳2（1湛江师范学院生命科学与技术学院 广东湛江 524048 ）（2广东海洋大学 广东湛江 524025）摘要：用浓度分别为1106、1105、1104pfu/mL的噬菌体进行生物防治实验，结果表明施加噬菌体的实验组对虾的死亡率明显比对照组低，且实验组对虾发病情况较轻。同时使水体中氨氮和亚硝酸盐含量等有不同程度的下降。凡纳滨对虾各组织器官含菌量实验表明，噬菌体对水体中弧菌的祛除可直接影响到对虾体内的含菌量，而噬菌体在清除水体中副溶血弧菌的同时对对虾体内的副溶血弧菌也有一定的清除作用。这对水产经济动物副溶血弧菌病的防治起着积极的作用。对对虾血淋巴中血细胞浓度测定发现，噬菌体的加入能使对虾血细胞含量保持相对稳定。关键词：副溶血弧菌，噬菌体，生物防治中国分类号：Q93 文献标识码： 文章编号：随着水产养殖结构的调整及WTO的加入，水产养殖必须走可持续发展的道路，实施健康养殖，使养殖的产品成为绿色食品。有益微生物在这方面大有用武之地。噬菌体是一种细菌病毒，它寄生和裂解细菌的生物学特性引起了人们极大的兴趣和关注。笔者研究了副溶血弧菌噬菌体对水体中和养殖对虾体内副溶血弧菌的消除及对养殖水生态环境的改善，旨在进一步探索噬菌体在防治鱼类细菌性疾病方面的应用效果，开拓鱼虾病生物防治的新途径，为养殖生产提供基础资料。1材料1.1 宿主菌株：本实验室分离、鉴定1-2的副溶血弧菌菌株。1.2 实验用虾：取自湛江市东海岛奄里村虾塘。2.实验方法2.1 凡纳滨对虾攻毒实验 根据文献3-,5的方法，略加改动。取平均体长约10cm的健康凡纳滨对虾，放养于水箱内，水100l，海水盐度18，虾48尾，室温。将试验分为15组，菌液浓度分别为1.0108；2.0107；4.0106；8.0105；1.6105cfu/ml；及不加菌的对照组，每天观察各组对虾的情况，并取4d后的各组对虾的血淋巴测定血细胞数目和各组织器官，检测含菌量。2.2 养殖条件下副溶血弧菌噬菌体对宿主的去除及对养殖生态环境的改善根据文献的方法6-11，进行噬菌体防治鱼类细菌性疾病的室内试验：时间为2004年7月、8月、9月、10月。试验用水箱共10只，其中6只为试验箱，4只为对照箱。每水箱加盐度为18的海水100l，凡纳滨对虾48尾。按时、定量投料，每天吸污。副溶血弧菌感染途径为浸泡感染：在室温下，用液体培养基将副溶血弧菌培养8h，然后将菌液离心，用灭菌海水洗涤，加入1、2、3和对照I组水箱，使箱内水体含菌量达1.0108个/ml。对照II组不做任何处理。三组试验箱内分别加噬菌体1.0106pfu/ml（1组）、1.0105pfu/ml（2组）、1.0104pfu/ml（3组），对照组不加噬菌体。每一浓度做两个平行，结果取两个平行的平均值。使用噬菌体后，每天观察各组对虾的情况；定时测定试验箱中水的pH、氨氮、COD、弧菌总数及副溶血弧菌数、细菌总数及噬菌体数，一天测一次，实验周期为一周，重复实验三次。细菌数量用胰蛋白胨琼脂平板记数法；弧菌记数用TCBS琼脂平板；噬菌体数量用双平板法；pH值测定用pH计；COD测定采用碱性高锰酸钾法；氨氮用奈氏试剂法；亚硝酸盐采用重氮偶氮比色法12。血球记数板记数各实验组的血细胞含量及取各实验组对虾的肝胰脏、鳃、肠，测定其中的含菌量。3结果3.1 凡纳滨对虾攻毒结果表1成虾攻毒实验结果实验用虾尾数菌浓度（pfu/ml）死亡数死亡率（%）发病数症716附肢发红和，不动，或沿水箱壁漫游，所有病虾均空胃，肝胰腺肿大，不摄食。248210748.316附肢发红，病症较轻34841060012附肢发红，病症较轻4488105000未见明显变化5481.6105000未见明显变化对照480000未见变化将试验四天后对虾用灭菌生理盐水冲洗，然后分离各部位，在灭菌匀浆器中加2ml灭菌生理盐水匀浆，再适当稀释后涂平板记数弧菌数量。并将各实验组的剩余对虾用灭菌注射器吸取血淋巴，用抗凝剂抗凝，然后用细胞记数板记数各实验组的血细胞含量。表2凡纳滨对虾各器官、组织的含弧菌量（cfu/g）及血细胞浓度（个/ml）肝胰腺肠鳃血细胞数12.11052.81071.11062.0210625.61043.51059.21052.8910633.81041.91055.31053.2210643.61031.91041.71053.2810652.91031.71042.51043.42106对照2.81031.51046.01034.11106由表2可看出，各实验组凡纳滨对虾的各部分的含弧菌量远比对照组多，特别是表现在肝胰脏和肠内菌量上，肝胰腺和肠内弧菌量大，是导致对虾患病的原因。随着水体中含菌量的加大，对虾的血细胞数目呈下降趋势，说明该副溶血弧菌具有溶血毒性。由于1.0108cfu/ml量的副溶血弧菌能让对虾出现明显的病症，所以在以下的实验中，用1.0108cfu/ml的菌量。3.2 养殖条件下副溶血弧菌噬菌体对细菌的去除及对养殖生态环境的改善3.2.1 凡纳滨对虾实验情况表3 噬菌体防治副溶血弧菌病的试验组别试验虾数（尾）菌量(cfu/ml)噬菌体添加量（pfu/ml）存活数（尾）存活率（%）死亡率（%）备注148110811064492848h后偶有轻微病症出现24811081105408317同上3481108110432673348h发病对照I481108020425824h发病，并陆续死亡对照II4800481000对虾生长良好由表3可看出，施加噬菌体的试验组，对虾死亡率明显比对照组低，且试验组发病对虾症状较轻，噬菌体使用浓度越高，对虾的发病程度就越轻，存活率就越高。3.2.2 副溶血弧菌噬菌体对对细菌数量和水质的影响表4 各组实验结果时间（d）123对照1对照2细菌总数031082.81082.91082.81081.8106(cfu/ml)12.6108210871083.51082106281078.51074.61084.61081.51063510751071.51085.2108310641.51066106310771084.210654105210611071108810665.21051.81061.210791075.110673.8105910551067.51072.2106弧菌总数01.41081.251081.31081.281083105(cfu/ml)181077.110761082.81083.410523.4107210721083.581084.7105311069106810751085.21054710511061.510731083.710553.91055105710681072.410564.21045.21048.210661072.410571.110331041.210671071.5105噬菌体数01.210631051.210400(pfu/ml)18.81063.21053.8104002110711061.11050034.91071.610641050042107810621060051.51079.410671050062.81065105310400741058104510300pH07.87.87.77.87.57.87.57.97.47.97.37.67.37.77.37.6COD(mg/L)018.9218.6019.0418.3218.48121.822.8411.5621.7218.00216.418.0010.2421.5616.12316.9218.6819.2219.8016.20417.217.9218.6420.8817.12516.8817.2818.3220.1617.35616.4116.8817.5220.4417.41氨氮00.450.440.470.460.4810.720.740.720.730.4920.700.720.710.740.5230.650.680.700.760.5840.520.610.680.780.6450.480.560.620.800.6760.440.520.580.820.66亚硝酸盐00.0730.0760.0810.0740.072(mg/l)10.0590.0640.0720.1020.08320.1070.1190.1280.1900.13430.1820.1650.1950.2110.18440.2600.2140.2420.2610.22950.3140.2690.2860.3170.27060.3470.3060.3280.3500.303细菌总数：方差分析表明，三个实验组和对照I组之间F=4.493，P=0.0140.05，差异显著。SNK法多重比较显示，1、2实验组之间细菌总数在5%水平上差异不显著。1、2和对照I组在5%水平上差异显著，第3组和对照I组差异不显著。弧菌数：方差分析表明，3个组之间弧菌数量F=4.397，P=0.0150.05，差异不显著。氨氮：F=7.076，P=0.0020.01，差异极显著，三个实验组5%水平上差异不显著，都和对照I组差异显著。亚硝酸盐：F=8.190，P=0.0010.01，差异极显著，三个处理组之间不显著，都和对照I组差异显著。细菌总数和副溶血弧菌菌群数：由结果可看出，噬菌体对池塘水体中的细菌和弧菌菌群都有明显的清除作用。这一结果还表明，水体中噬菌体浓度越高，数量越多，对细菌和弧菌的清除作用就越强。噬菌体数量：由表可知，当噬菌体开始清除细菌时，其本身得到增殖，当弧菌减少时，噬菌体的数量反而减少。这充分说明，噬菌体与宿主菌本身有很大关系13-14。pH值、氨氮、COD、亚硝酸盐：由方差分析可知，噬菌体对水质可产生不同程度的有利影响。三个实验组氨氮的测定值明显比对照I组低，也比对照II组低，去除率达19.438.9%；亚硝酸盐含量也明显降低。3.2.3凡纳滨对虾各组织、器官中弧菌含量如下表：表5 对虾各组织器官的弧菌含量（cfu/g）时间（d）1组2组3组对照1对照2鳃13.061054.51056.31063106310425.81055.91061.91062.81068.110434.61041.41042.41047.71067.710343.810621051.21053.61072.210552.111052.71051.141058.21064.810462.71052.81053.31051.21074.3105肝胰脏18.941054.11052.61054105210329.11047.91052.61052.11058.510335.21049.91052.51052.3105610341.11031.61041.11052.51052.110355.161031.871049.741046.21056103691028.31032.91044.11068.9103肠14.031076.21072.01062.11072.510424.61077.310611085.21082.210435.21066.41073.81073.51083.510442.21051.41063.51071.11087.310451.401057.621051.31069.21075.310463.71048.410451055.61071.6104方差分析表明，三个实验组和对照I组之间，F=3.570，P=0.0170.05，差异显著。各组织之间F=6.884，P=0.0000.01，差异极显著。SNK法多重比较显示，1、2、3实验组之间弧菌数量差异不显著，但三个处理组和对照I组在5%水平上差异显著。肝胰脏、腮之间差异不显著，但都与肠中的弧菌量在5%水平上有显著差异。由结果可看出，噬菌体对水体中弧菌的去除可直接影响到对虾的腮、肠等的含菌量，对对虾副溶血弧菌病的预防起着积极的作用。同时实验说明，副溶血弧菌噬菌体，在清除水体中副溶血弧菌的同时对对虾体内的副溶血弧菌也有一定的清除作用，这对对虾弧菌病的治疗提供了一个理论依据。3.2.4 不同实验组中的血细胞浓度表6各试验组对虾的血细胞浓度（个/ml时间（d）123对照1对照214.501064.201064.301064.001064.5010624.451064.261064.211063.521067.210634.521064.231063.661062.81064.710644.631064.241063.841062.961065.610654.321063.981063.141063.021064.410664.211064.181063.841063.121064.0106由表6可知，6天后对照I组对虾血细胞数量约比实验组低18%25%，在第3天这个差距达到38%，再次证明副溶血弧菌及其代谢产物有溶血毒性，而噬菌体对副溶血弧菌的消除能使对虾血细胞数量保持相对稳定。4讨论据专家认为水体内弧菌总数高于104cell/ml对虾会发病13，国家海洋局第三海洋研究所的倪纯治等(1995) 3的研究发现，当池水中细菌数达到8.01065.0108个/dm3时，于72h后即出现死亡，死亡数随着弧菌数的增多而增多。本实验结果显示，高浓度的副溶血弧菌才能使对虾患病死亡。曹立业等(1996)15认为，细菌性病和病毒性病有很多是同时存在的,我们认为在对虾带有病毒再感染副溶血弧菌时，即使是低浓度的副溶血弧菌也可使对虾患病，且一发不可收。郭平、许美美(1994)4的研究，养殖水中异养菌的最高值为3.4105cell/ml，弧菌为1.9105cell/ml。而本实验是在养殖水中含菌量较高的7、8、9、10月份做的，对照组II中的细菌总数和弧菌数与郭平的研究一致。倪纯治的研究表明，虾体中弧菌数约2.31022.9106个/g，均值为2.9104个/g1，与本实验中对照II的对虾各部分的含弧菌量实验结果相似。本实验中，在高浓度噬菌体存在下，凡纳滨对虾仍有8%的死亡率。我们推测，在添加噬菌体之前，水体中已存在高浓度致病弧菌，在加入高浓度噬菌体后，噬菌体对致病菌的去除需要一定的时间，实验结果中，加入噬菌体24h后，弧菌数量减少了1个数量级，而在这24h内，对虾始终处于高浓度致病菌条件下，所以同样会出现死亡，实验也证实，噬菌体存在下对虾出现的死亡出现在前两天。本研究结果为将噬菌体裂菌技术应用于环境净化及水产病害防治奠定了基础，为将噬菌体作为一种生物“消毒剂”应用于环境净化提供了依据。参考文献：1 东秀珠，蔡妙英等. 常见细菌系统鉴定手册北京：科学出版社，2001，1061162 Holt J G，Krige N R，et al. Bergeys manual of bacteriology(9th Ed)M.1994，London：Williams and Wilkins Press.3 倪纯治，林燕顺，叶德赞,等. 海水养殖池的几种致病弧菌生态J. 台湾海峡,1995，14（1）：73794 陶保华，胡超群，任春华. 副溶血弧菌对斑节对虾和日本对虾的致病力研究J. 中国水产科学，2000，7（3）：1171195 李天道，于佳，余开康. 四种弧菌对中国对虾的致病性研究J. 海洋湖沼通报，1998，6 (1)：57646 何义进，邢华. 噬菌蛭弧菌防治鱼类细菌性疾病的应用研究J. 水产科技情报，1996, 23 (5)：2202247 陈俊芹，吕人豪. 应用噬菌体控制工业循环冷却水中有害微生物的研究J. 应用生态学报，1994，5（1）：83888 杨淑专，黄庆辉. 蛭弧菌指示和净化海水的研究J. 厦门大学学报(自然科学版)，1997，36 (6)：9319349 高尚德，陈旭仁，吴以平. 中国对虾养成期间虾池水体和底质中细菌含量的变化J. 水产学报，1994，18（2）：13814210 陈家长，简纪常，胡庚东,等. 利用有益微生物改善养殖生态环境的研究J. 湛江海洋大学学报，2002，22 (4)：333611 李戈强，章勇良，徐伯亥. 不同条件下蛭弧菌裂解河流弧菌的研究J. 水生生物学报，1998，22（3）：22527112 陈佳荣. 水化学实验指导书M. 第一版，北京：中国农业出版社，1996，12616413 靳素英，张成刚，崔明，学. 自然环境中噬菌体与其宿主间的相互作用J. 生态学杂志，1998，17 (3)：424514 Fasano A，Baudry B，Pumplin D W，et al. Vibrio cholerae produces a second enterotoxin which affects intestinal tight junctionJ. Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：52425246.15 曹立业. 关于养虾池水质监测指标的建议J. 水产科学，1996，15（6）：22237The study of Vibrio parahaemolyticus phages in biocontrolLin Hongping1 Qiu Dequan2 Tan Longyan2(1 Institute of life sciences and technology, zhanjiang normal university zhanjiang,guangdong 524048; 2 Marian research and development center of guangdong province ,guangdong ocean university zhanjiang, 524025)Abstract:The biocontrol test of the phage the concentrations of whi