基因工程知识点.doc

基因工程各章知识点11第一章 绪论1基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和 DNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R65和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（ pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA技术。供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。3基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。第二章 载体1理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理: PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tetr 基因内有7个酶切位点：Bam H，Sal：Ampr基因内有3 个酶切位点：Pst。Eco R和Hind不在抗生素基因内，不导致插入失活。如果在pBR322质粒的Tetr 基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tetr基因编码序列的连续性，使tetr失去活性，产生出Ampr Tets表型的重组pBR322质粒，转化入Amps Tets的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Ampr 基因内位点插入外源DNA片断，则反之。PUC18作载体的克隆外源基因的原理： 在pBR322的基础上，在其5-端带有一段多克隆位点的lacZ基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。典型的pUC系列的质粒载体包括如下4个组成部分：a、pBR322的复制起始点。b、氨苄青霉素抗性基因但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。c、大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及编码-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ基因。d、位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。2理想载体的必备条件（1）、较小的分子量和较高的拷贝数。（2）、应最大限度的具有各种常用限制性内切酶的单一酶切位点。（3）、具两种以上的选择标记基因。（4）、重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。3穿梭载体和a-互补A 穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。 常见的穿梭质粒有大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体。B lacZ基因的突变体M15质粒（缺失氨基酸残基11到41）是没有野生型lacZ基因产物那种分解X-gal能力的。但如果在M15突变体的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸残基的肽段（肽）则能恢复M15分解X-gal，而显示蓝色的能力。这样一种基因内互补现象称做互补。 第三章 核酸操作的基本技术1碱解法提取质粒DNA的原理？提取DNA时常用试剂的作用原理碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。常用试剂的作用溶菌酶：溶解菌体细胞壁的-1，4糖苷键，即具溶菌作用。葡萄糖：增加溶液粘度，防止DNA受机械切力作用而降解EDTA：金属离子螯合剂，抑制脱氧核糖核酸酶（Dnase)对DNA的降解作用SDS：阴离子表面活性剂，可破坏细胞膜，使DNA释放出来，结合蛋白质，使蛋白质沉淀下来抑制脱氧核糖核酸酶（RNase)的活性。酚、氯仿：蛋白质变性剂。使蛋白质失水变性，；离心后与水相（含DNA）分离。异戊醇：降低分子表面张力，可减少气泡的产生；有助于分相。无水乙醇：DNA的沉淀剂。夺取DNA周围的水分，使DNA失水而易于聚合。NaOH：核酸在pH=59的溶液中稳定，pH12或pH载体片段10-20倍。c适当加大酶的用量，但单位含酶量低时，随着用量的加大，甘油含量也提高了，反而影响连接效率。d用碱性磷酸酶处理载体，使5-P变为5-OH，减少载体自连，提高重组分子形成比率。3平齐末端的连接方法A、直接用T4连接酶连接B、同聚物加尾法：不需模板链的存在，末端脱氧核苷酸转移酶可将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。故在反应物中存在一种脱氧核苷酸的条件下，便构成由同一种类型核苷酸组成的多聚核苷酸尾巴，当两种DNA分子带有可互补配对的poly尾巴时，能彼此连接起来，此种连接方式称为同聚物加尾（一般加10-40个碱基就足够了）。应用（1）、酶切后形成的平齐末端。（2）、机械切割大分子DNA产生平齐末端。（3）、RNA：cDNA具有平齐末端。缺点：无法在尾巴处（原位）再进行切割。C、衔接物连接法：所谓衔接物（linker)是指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平齐末端的双链寡聚核苷酸片段。将衔接物的5末端和待克隆的DNA的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4连接酶的作用将两者连接起来。接着用适当的RE消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者产生出了的互补的粘性末端，则可用连接酶将DNA分子和载体分子按常规的粘性末端连接法将二者连接起来。优点：兼具同聚加尾法和粘性末端法各自的优点；可以根据实验需要设计不同RE识别位点的衔接物，从而大提高平齐末端DNA片段的连接效率；可实现外源片段定向克隆。缺点：基因内部有相同酶位点时，酶切会把该基因切断，从而给后续的亚克隆和其他操作带来麻烦。D、接头连接法第六章 转化及重组体的鉴定1感受态感受态：凡是能吸收游离DNA片段的细菌称为感受态细菌或者说处于感受态；正常生长条件下的一个或多个不同生长时期都处于高度感受态的细菌；经过特殊处理才表现感受态；对于转化表现强烈抑制的细菌。2在DNA水平上检测转化体的方法有哪些；RNA水平的检测方法。答案不确定DNA水平上质粒DNA的提取和限制性酶切分析；质粒DNA与分子杂交。观察是否有表型变化的重组体。联合运用直接和间接的手段进行快速而准确的鉴定。重组体的筛选：直接选择法：抗药性标记选择，插入失活法；标志补救如互补；分子杂交法原位杂交；Southern印迹。非直接选择法：免疫学方法如免疫化学方法酶免检测法。第七章 目的基因的获得1什么是cNA？如何通过构建cNA文库和基因组文库获得目的基因cDNA（complementary DNA)：是指与mRNA 互补的DNA，是由mRNA通过反转录酶进行反转录而成的。cDNA文库的构建基本过程：通过一系列的酶促作用，使总poly(A)mRNA制剂转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含产所有基因编码的cDNA基因文库（cDNA library)。mRNA 反转录酶 cDNA 复制 双链cDNA 载体 重组DNA分子 受体菌 含重组DNA分子的受体具体步骤第一步：分离总RNA，然后从总RNA中分离出mRNA部分，约占细胞总RNA的1-2。第二步：以mRNA为模板，经过逆转录合成第一条cDNA。第三步：将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。第四步：将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体上。第五步：将重组分子转入大肠杆菌主细胞中进行增殖。应用噬菌体构建基因组文库：1、基本步骤：从供体基因组DNA产生适当大小的DNA片段；在体外将这些DNA片段同适当的噬菌体连接成重组分子；转化到大肠杆菌的受体细胞中去；从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。2. 供体DNA制备：（1）、机械切割产生合适大小的外源DNA片段。（2）、RE的部分消化产生合适大小的外源DNA片段。从基因组DNA文库获取目的基因：组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片段 克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化2PCR的原理；引物；简并引物；RT-PCR;PCR的原理：实质为体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物中的四种dNTPs，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的DNA互补链。理想拷贝数=2n，（n：循环次数）；实际拷贝数=(1+x)n，（X：平均效率,约为0.85，n：循环次数）9引物 定义：是（两条）人工合成的与模板DNA互补的核苷酸链长度:一般为15-30bp，且与单链DNA模板互补，短的6-12bp,长的35bp。两引物与模板结合位点之间的距离决定了扩增区段的长度，1kb为理想的扩增跨度，2kb左右为有效扩增跨度。简并引物：简并引物是由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间仅有一个或数个核苷酸的差异。RT-PCR:先将RNA转录成cDNA，接着以cDNA为模板进行PCR扩增。这一技术称为反转录PCR（reverse transcription PCR RT-PCR)。3设计简单的引物；如何通过PCR获得目的基因给出DNA序列，写出引物第八章 凝胶电泳与分子杂交1如何通过琼脂糖凝胶检测DNA（电泳的原理及影响因素）电泳原理在生理条件下，核酸分子是多聚阴离子当核酸分子被放置在电场当中时，它们就会向正电极的方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。琼脂糖凝胶电泳（agrose gel electrophisis）（1）支持介质：琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。（2）分辨能力：琼脂糖凝胶基质的孔径大小可以通过调整琼脂糖的浓度来改变。其分辨力为为0.250kb范围之间的DNA片段；凝胶浓度越大，介质孔径越小，分辨能力越强。影响DNA电泳的因素DNA分子大小、DNA分子构型、凝胶浓度、电场强度、EB、电泳缓冲液2Southern杂交；缺口平移法制备探针Southern杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E. Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹转移技术。缺口平移法制备探针：首先用适当浓度的DNA酶（DNAse）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶（DNa poly meras）的53的外切酶活性，切去带有5磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的53聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。3什么是Northern杂交和western杂交Northern杂交：将变性（用甲醛、乙二醇，防止RNA形成二级结构）琼脂糖胶电泳分离的RNA或mRNA，转移吸印到特殊（叠氮化的或其它化学修饰的）的活性滤膜或滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起，与标记的探针RNA或DNA杂交，然后放射自显影以分析RNA（大小、数量）的方法，这种方法同萨瑟恩的DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺塞恩RNA吸印杂交技术（Northern blotting）。western杂交:将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125标记的特定蛋白质之抗体进行反应，以检测蛋白质的杂交技术，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（ Western blotting）。第九章 测序Sanger测序的原理（2分题）利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定核苷酸顺序的方法。也称为引物合成法或酶催引物合成法。原理：DNA聚合酶能利用单链DNA为模板，离体合成出其互补链，当反应液中存在2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它可以象2-脱氧核苷三磷酸（dNTP）那样直接掺入新合成的DNA链中，但因ddNTP 3 端不具-OH基团，所以寡核苷酸链就不能再继续延长了即DNA链合成中止了。第十章 植物基因工程1反义核酸 Ti质粒 GFP反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156106D, 约有200kb左右。具有接合转移特性GFP（绿色荧光蛋白基因）：这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。2Ti质粒的改造应掌握以下几个原则：a、保留TDNA的转移功能和vir区。b、除去TDNA的致瘤性（激素基因）。 c、通过简便手段使外源DNA插入TDNA ，并可随之整合到植物染色体上。3农杆菌转化的原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、茎段等共同培养的一种转化方法。转化过程：再生体系的建立转化共培养法筛选再生检测southern blotting 和PCR检测(田间检测)4如何筛选理想的转基因植物通过筛选得到的再生植株初步证明标记基因整合进入受体细胞。至于目的基因是否整合到受体核基因组、是否表达，还必须对抗性植株进一步检测。(1) DNA水平的鉴定检测内容：是否整合、拷贝数、整合位置。检测方法：特异性PCR（以外源基因两侧序列设计引物）Southern杂交（外源目的基因序列为探针）(2) 转录水平的鉴定常用的方法：Northern杂交（标记的RNA为探针对总RNA杂交）RT-PCR 检测（3）翻译水平的鉴定为检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译，还必须进行翻译或者蛋白质水平检测。主要方法：Western杂交、免疫检测第十一章 外源基因的表达判断题出2分基因工程各章复习纲要第一章