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第九章酶促反应动力学 Enzyme 什么叫酶促反应动力学 Kineticsofenzyme catalyzedreaction 酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学 是酶工程研究中的一个重要内容 一 化学动力学基础 351 351页 概念研究各种因素对酶促反应速度的影响 影响因素包括有底物浓度 pH 温度 抑制剂 激活剂 酶浓度等 研究一种因素的影响时 其余各因素均恒定 一 化学动力学基础 351页 影响酶促反应速率的因素 底物浓度 S 酶浓度 E 反应温度pH值抑制剂I激活剂A 在低底物浓度时 反应速度与底物浓度成正比 随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速 当底物浓度达到一定值反应速度达到最大值 Vmax 此时再增加底物浓度 反应速度不再增加 二 底物浓度对酶反应速度的影响 在其他因素不变的情况下 底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系 355 二 底物浓度对酶反应速度的影响 2中间络合物学说 355 首先酶 E 与底物 S 结合 生成不稳定的中间产物 ES 然后中间产物再分解成产物 P 并释放出酶 E 中间产物学说的关键在于中间产物的形成 酶和底物可以通过共价键 氢键 离子键和和配位键等结合形成中间产物 中间产物的稳定性较低 易于分解成产物并使酶重新游离出来 二 底物浓度对酶反应速度的影响 2中间络合物学说 1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式 即米 曼氏方程式 简称米氏方程式 Michaelisequation 后来又有人进行了修正 S 底物浓度V 不同 S 时的反应速度Vmax 最大反应速度 maximumvelocity m 米氏常数 Michaelisconstant 米氏方程 二 酶促反应的动力学方程式 二 底物浓度对酶反应速度的影响 反应刚刚开始 产物的生成量极少 逆反应可不予考虑 S E 反应达到稳态 米氏方程式推导基于以下前提 1925年Briggs和Haldame对米氏方程作了一次重要的修正 提出了恒态 稳态 的概念 所谓恒态是指反应进行一定时间后 ES的生成速度和ES的分解速度相等 亦即ES的净生成速度为零 此时ES的浓度不再改变 达到恒态 也称稳态 根据中间产物学说 酶促反应分两步进行 米氏方程的推导 接上 米氏方程 S 底物浓度V 不同 S 时的反应速度Vmax 最大反应速度 maximumvelocity m 米氏常数 Michaelisconstant Km 米氏常数 三个速率常数的复合常数 当 S Km时 v Vmax Km S 即v正比于 S S Km时 v Vmax 即v与 S 无关 当 S Km时 v Vmax 2 米氏方程式解释 米氏方程表明了当Km和Vmax都已知时 酶反应速度与底物浓度间的定量关系 等于 k3 k2 k1 Km值 是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度 它的单位是mol L 与底物浓度的单位一样 2动力学参数的意义 a 不同的酶具有不同Km值 它是酶的一个重要的特征物理常数 只与酶的性质有关 而与其浓度无关b Km值只是在固定的底物 一定的温度和pH条件下 一定的缓冲体系中测定的 不同条件下具有不同的Km值 C 一般情况下 1 Km可以近似地表示酶对底物的亲和力大小 1 Km愈大 表明亲和力愈大 同一种酶有几种底物就有几个Km值 其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物 359 5 当反应速度达到最大反应速度的90 则 90 Vmax 100 Vmax S Km S 即 S 9Km 1 v对 S 作图 3利用作图法测定Km和Vmax 2 双倒数作图法 1 Km 1 Vmax 斜率 Km Vmax 1Km11 VVmax S Vmax 1 v对 S 作图 362 3 v对作图 Eadie Hofstee法 363 4 S v对 S 作图 Hanes Woolf法 363 Eisenthal和Cornish Bowden法 5 直接线性作图法 363 米氏方程成立条件 单底物pH T E 不变底物为液态 S E 稳态 steadystate 三 多底物的酶促反应动力学 A BP Q 双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 双底物双产物的反应 序列反应 sequentialreactions 乒乓反应 pingpongreactions 有序反应 orderdreactions 随机反应 randomreactions 364 1 序列有序反应 orderedreactions写作orderedBiBi A为领先底物 E A B ABE PEQ E P Q 2 序列随机反应 randomreactions 写作RandomBiBi 特点是 底物A和B随机和酶结合 产物P和Q随机和酶脱离 3 乒乓反应 pingpongreactions 写作uniuniuniunipingpongorPingPongBiBi 特点 酶同A的反应产物 P 是酶同第二个底物结合之前释放出来 相应的酶转变E 一 抑制作用与抑制剂 二 抑制作用的类型 三 可逆抑制作用的动力学特征 四 一些重要的抑制剂 三 酶的抑制作用 凡使酶的活性降低或丧失 但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用 主要是由于酶的必需基团化学性质的改变而引起的 抑制作用不同于失活作用 能够引起抑制作用的化合物则称为抑制剂 抑制剂不同于变性剂 三 酶的抑制作用 一 抑制作用与抑制剂 什么是酶的抑制作用和失活作用 失活作用 酶变性 酶活性丧失 无选择性 抑制作用 酶的必需基团的化学性质改变 但并不引起酶蛋白变性的作用 而降低酶活性甚至使酶完全丧失活性的作用引起作用的物质称为抑制剂 I 选择性 研究抑制作用的意义 一 抑制作用与抑制剂 a 不可逆抑制作用b 可逆抑制作用 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 专一性不可逆抑制作用非专一性不可逆抑制作用 三 酶的抑制作用 二 抑制作用的类型 定义 抑制剂通常以共价键与酶的必需基团相结合 使酶失活 1不可逆抑制作用 修饰抑制 三 酶的抑制作用 二 抑制作用的类型 有机磷化合物对羟基酶的抑制 活性部位 activesite 或活性中心 activecenter 酶分子上只有少数特异的氨基酸残基参与底物结合及催化作用 这些特异的氨基酸残基比较集中的区域 即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位 路易士气 失活的酶 巯基酶 失活的酶 酸 BAL 巯基酶 BAL与砷剂结合物 五 一些重要的抑制剂 非专一性不可逆抑制剂a 有机磷化合物 与酶活性直接有关的丝氨酸上的 OH牢固地结合 从而抑制某些蛋白酶或酯酶 敌百虫 敌敌畏 农药1605等 b 有机汞 有机砷化合物 与酶蛋白上的 SH作用 从而抑制含 SH酶的活性 对氯汞苯甲酸 三 酶的抑制作用 1 不可逆抑制剂 3 重金属 Ag Cu Hg等盐能使大多数酶失活 加入EDTA可以除去 4 烷化剂 这一类试剂中往往含一个活泼的卤素原子 如碘乙酸 碘乙酰胺和2 4 二硝基氟苯等 使酶蛋白中的 SH NH2 OH等发生烷基化 失活 5 氰化物 硫化物和CO 这类物质能与酶中的金属离子形成较为稳定的络合物 使酶的活性受到抑制 6 青霉素 抗菌素类药物 与糖肽转肽酶活性部位Ser OH共价结合 使酶失活 自杀性底物 五 一些重要的抑制剂 三 酶的抑制作用 1 不可逆抑制剂 竟争性抑制非竟争性抑制反竞争性抑制 2 可逆抑制作用 三 酶的抑制作用 二 抑制作用的类型 抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合 引起酶活性暂时性丧失 抑制剂可以通过透析等物理方法被除去 并且能部分或全部恢复酶的活性 根椐抑制剂与酶结合的情况 又可以分为三类 1 竟争性抑制 抑制剂与底物的结构相似 能与底物竞争酶的活性中心 从而阻碍酶底物复合物的形成 使酶的活性降低 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度 即提高底物的竞争能力来消除 363 三 酶的抑制作用 二 抑制作用的类型 2 可逆抑制作用 抑制剂与底物的结构相似 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同 酶的活性中心 竟争性抑制举例 1 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制 磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 人体细胞的叶酸由食物获得 不受磺胺类药物的抑制 S I 高浓度的底物可解除抑制 特点 竞争性抑制剂往往是酶的底物结构类似物 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同 酶的活性中心 抑制作用可以被高浓度的底物减低以致消除 表观 Km值增大 Vm值不变 竞争性抑制作用的Lineweaver Burk图 1 Vmax 表观 Km值增大 Vm值不变 2 非竟争性抑制 酶可同时与底物及抑制剂结合 即底物和抑制剂没有竞争作用 酶与抑制剂结合后 还可与底物结合 酶与底物结合后 也可再结合抑制剂 但是三元的中间产物不能进一步分解为产物 所以酶活性降低 三 酶的抑制作用 2 可逆抑制作用 非竞争性抑制的特点 非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似 抑制剂与酶的活性中心外的位点结合 抑制剂对酶与底物的结合无影响 故底物浓度的改变对抑制程度无影响 抑制程度取决于抑制剂的浓度 动力学参数 Km值不变 Vm值降低 加入非竞争性抑制剂后 Km不变 而Vmax减小 非竞争性抑制作用的Lineweaver Burk图 加入非竞争性抑制剂后 Km不变 而Vmax减小 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合 这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱 3 反竞争性抑制 酶只有与底物结合后才与抑制剂结合 形成的三元中间产物不能进一步分解为产物 反竞争性抑制作用常见于多底物反应中 而在单底物反应中比较少见 三 酶的抑制作用 二 抑制作用的类型 2 可逆抑制作用 加入非竞争性抑制剂后 Km减小 而Vmax减小 反竞争性抑制作用的Lineweaver Burk图 加入反竞争性抑制剂 使Km和Vmax均减小 可逆抑制的动力学比较 抑制类型VmaxKm无抑制剂VmaxKm竞争性抑制不变变大非竞争性抑制变小不变反竞争性抑制变小变小 四 可逆抑制作用的动力学 三 酶的抑制作用 酶的最适温度 酶活性最高时的温度 也即酶的催化效率最高 酶促反应速度最大时的温度 四 温度对酶反应速度的影响 最适温度不是一个固定的常数 它受底物的种类 浓度 溶液的离子强度 pH 反应时间等的影响 例 反应时间短 最适温度高 反应时间长 最适温度低 温度系数 当温度增高10摄氏度 反应速度与原来反应速度的比 对于大多数酶 温度系数为2 酶的最适pH 酶催化活性最高时的pH 2810pH 酶的活性 A 胃蛋白酶 B 葡萄糖 6 磷酸酶 A B 五 pH对酶反应速度的影响 最适pH与最适温度一样 也不是一个固定的常数 它随底物的种类 浓度 溶液的离子强度 pH 反应时间等的影响 一些酶的最适pH值 酶最适pH胃蛋白酶1 8过氧化氢酶7 6胰蛋白酶7 7延胡索酸酶7 8核糖核酸酶7 8精氨酸酶9 8碱性磷酸酶10 5 pH对酶作用的影响机制 1 酸 碱可使酶变性或改变构象失活 2 影响酶活性基团的解离 3 影响底物的解离 4 影响ES的解离 六 激活剂对酶反应的影响 什么是酶的激活剂 activator 凡能提高酶活性的物质都是酶的激活剂 包括 1 无机离子 1 一些金属离子 如Na K Mg2 Ca2 Cu2 Z