蛋白质芯片ppt文稿.doc

1、 固相载体：其中玻片是较理想的片基，因为玻片具有1、背景信号较少，2、表面活性基团主要为羟基，有利于表面的进一步修饰，等优点2、 探针蛋白：有序地排列在芯片形成微阵列所以蛋白质芯片又叫蛋白质微阵列，选择的探针应能与待测蛋白结合才可3、探针与载体的连接方式主要有以下几种：（） 表面吸附（如静电力或疏水作用）：由于吸附作用力较弱而使得探针易从载体上脱落；（） 共价结合：要求载体必须经修饰后带上亲电子基团，从而与探针上的亲核基团发生共价耦合，目前这种方式使用较为普遍；4、以质谱技术为基础的直接检测法不需标记，标记样品中的蛋白质主要是为再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质相互作用，最终确定蛋白质功能，标记物主要是荧光物质或同位素5、(1)快速、定量分析大量蛋白质蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白表达(2) 灵敏度高，采用光敏染料标记，使信号变大。质谱仪它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在如果要想一次检测多种样品而且只需极少量试剂，食品中兽药残留快速检测兽药残留，蛋白质芯片技术更合适6、自组装蛋白质芯片借助已有的DNA 芯片点样技术和体外表达技术, 将编码蛋白质的序列点样在芯片表面进行体外表达制成蛋白质芯片 。这种芯片能够直接利用已有的大量的cDNA 文库,克服了蛋白质纯化、保存等问题。实验思路为: 首先将末端段含有GST 的cDNA 序列和GST 多抗在片基上点样并体外表达后, C段含有GST 标的蛋白质会特异性地与GST 抗体发生结合。因为GST 位于蛋白质序列C 末端, 所以用GST 单抗检测蛋白质是否发生表达, 如果有信号就认为蛋白质序列已经被完整表达。确定蛋白质表达情况后, 用另一张完全相同的芯片进行体外表达, 并加入拟研究的蛋白质或其它物质检测其与阵列蛋白质的相互作用关系7、蛋白质芯片病原微生物的检测随着经济全球化的发展, 动植物食品卫生的检验成为WT O 的贸易技术壁垒。Row e等 13 建立了一种基于荧光免疫检测方法的抗体芯片。其基本原理是将针对抗原的特异性识别抗体点布于片基上用于捕获样品中的待测抗原, 制备抗体芯片, 与待测的样品中的抗原结合后, 再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质相互作用，最终确定蛋白质功能。8、常用的转基因作物检测方法有检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法/生物测定检测法等。但这些方法只能对单个检测目标进行检测，并存在假阳性高或检测时间周期长等问题与采用ELISA 方法检测单种兽药的检测时间即需2h 左右相比, 采用芯片进行检测时, 所有兽药的总检测时间小于2h。同时, 蛋白质芯片检测灵敏度高, 超过了我国及欧盟等国家和地区对最高残留检测限量的要求。传统的ELISA 方法操作复杂, PCR 的方法有相当的漏检率, 而且难以满足对大量样品的同时检测。蛋白质芯片技术的发展为此类动物疾病的检测提供了有力的武器3、 其原理是固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上，根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白，经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持蛋白质芯片是将各种蛋白质有序地固定于固相支持物表面制成芯片，然后将带有特殊标记( 如荧光染料) 的样品蛋白质与芯片上的探针蛋白杂交，漂洗未能与芯片上的探针蛋白结合的蛋白，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质相互作用，最终确定蛋白质功能。Zhu 等12 为了进一步研究酵母蛋白质组，制备了5 800 种蛋白的高密度蛋白质芯片，筛选与它们有相互作用的蛋白质和磷脂质，发现许多新的钙调素、磷脂质作用蛋白。随后，Ptacek 等13 利用该方法研究了酵母激酶的相互作用蛋白，确定了4 000 多个磷酸化反应，涉及1 325种不同的蛋白，这些结果被整合进第一代酵母磷酸化图谱中，为研究真核细胞中蛋白磷酸化的机制奠定基础。该方法快速、简便、高通量，可检测出一些通常难以鉴定的低丰度、小相对分子质量蛋白，但与靶蛋白结合的特异性有待提高。蛋白质芯片，狭义的表达是蛋白质微阵列（protein microarray）, 是用于蛋白质功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或者共价结合等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析，是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成分进行高通量检测最早进行蛋白质芯片研究的是德国科学家Lueking6;7载体选择目前制作芯片的载体材料最常用的有硝酸纤维素（）膜、聚偏二氟乙烯（）膜、硅胶和玻片等。其中玻片是较理想的片基，因为玻片具有许多优点，例如背景信号较少，表面活性基团主要为羟基，有利于表面的进一步修饰。玻片表面的不渗透性使得样品点样后不易扩散，可尽量缩小点样间距以提高点样密度，同时也可加快蛋白质之间的反应进程。配基选择-探针蛋白蛋白质微阵列中分子的相互作用是发生在两相间，即固相上的探针与液相中靶标分子的特异性结合。因而探针的选择及其在固相载体上固定的状况直接决定着探针生物活性的保持，而后者又是构建蛋白质微阵列的前提条件。所选探针必须在环境中稳定，并且即使是样品中靶标分子浓度很低都必须能对其进行识别，即特异性及亲和性要高，因此在蛋白质检测微阵列中，抗体是使用最多的捕获配基。此外，多肽因其具有较高的稳定性，易操作性且成本低廉正逐渐引起人们的研究兴趣连接方式探针与载体的连接方式主要有以下几种：（） 表面吸附（如静电力或疏水作用）：由于吸附作用力较弱而使得探针易从载体上脱落；（） 共价结合：要求载体必须经修饰后带上亲电子基团，从而与探针上的亲核基团发生共价耦合，目前这种方式使用较为普遍；（） 物理包埋：所用基质（如琼脂糖凝胶）的三维结构可为探针提供一个温和的环境，既减少了探针变性的可能性，又不影响探针的功能位点，同时具有较高的蛋白荷载能力，稳定性和重现性较好，与前两种连接方式相比，更具有应用价值。以上种连接方式唯一相同的是探针与载体的连接是随机的，但如果将通过重组技术标记于探针上，利用与修饰载体表面金属的螯合作用，则可实现探针固定的有序，从而更有利于探针与靶蛋白的相互结合，使得所构建的微阵列可用于生化反应的定量分析。检测方法用蛋白质微阵列对样品进行分析，目前，蛋白质芯片的检测方法主要可分为两大类：以质谱技术为基础的直接检测法不需标记，标记样品中的蛋白质主要是为随后采用CCD 照相技术及激光扫描系统等对信号检测准备，标记物主要是荧光物质或同位素（） 无标记检测方法：主要为各种仪器的检测，如质谱、表面等离子共振、原子力显微镜等。其中被形象地称为具有飞行质谱技术的表面增强激光解吸离子化解决了样品在检测时需进行分离和纯化等繁琐的前处理问题。此外，有人将具有电导能力的碳纳米线或纳米管应用于蛋白质芯片的信号传感系统，其检测限范围甚至达到飞摩尔级（） 标记检测方法：利用标记物所具有的荧光、化学发光等性质，再通过激光共聚焦扫描系统或电荷耦合照相系统对信号进行放大和分析。2、根据芯片表面的不同化学成分化学表面芯片、生物表面其中化学表面芯片又可分为疏水、亲水、阳离子、强阴离子和金属离子螯合芯片五种, 用于检测未知蛋白, 并获取指纹图谱生物表面分为抗体/抗原、受体/配体和DNA蛋白质芯片等种类, 可显示与之结合的抗原或配体的不同分子量亚型。具体方法是将包括特定蛋白质的抗体或受体, 结合某些阳离子或阴离子的化学基团、吸水或疏水物质、酶等的探针以特定方式固定在载体表面, 形成一个个点状芯池, 制备时通常采用直接点样法, 以避免蛋白质的空间结构改变, 保持它与样品的特异性结合能力3、与传统的研究方法相比有以下特点：(1)快速、定量分析大量蛋白质蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白表达谱(2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级，采用光敏染料标记(3)所需的样品量极少如果要想一次检测多种样品而且只需极少量试剂，食品中兽药残留快速检测兽药残留，蛋白质芯片技术更合适、定位于固相载体表面的蛋白质容易因空间构象的改变而失活定，造成了该类芯片的开发应用与商品化落后于化学型芯片4、 自组装蛋白质芯片借助已有的DNA 芯片点样技术和体外表达技术, 将编码蛋白质的序列点样在芯片表面进行体外表达制成蛋白质芯片 。这种芯片能够直接利用已有的大量的cDNA 文库,克服了蛋白质纯化、保存等问题。实验思路为: 首先将末端段含有GST 的cDNA 序列和GST 多抗在片基上点样并体外表达后, C段含有GST 标的蛋白质会特异性地与GST 抗体发生结合。因为GST 位于蛋白质序列C 末端, 所以用GST 单抗检测蛋白质是否发生表达, 如果有信号就认为蛋白质序列已经被完整表达。确定蛋白质表达情况后, 用另一张完全相同的芯片进行体外表达, 并加入拟研究的蛋白质或其它物质检测其与阵列蛋白质的相互作用关系。5、常用的转基因作物检测方法有检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法/生物测定检测法等。但这些方法只能对单个检测目标进行检测，并存在假阳性高或检测时间周期长等问题与采用ELISA 方法检测单种兽药的检测时间即需2h 左右相比, 采用芯片进行检测时, 所有兽药的总检测时间小于2h。同时, 蛋白质芯片检测灵敏度高, 超过了我国及欧盟等国家和地区对最高残留检测限量的要求。传统的ELISA 方法操作复杂, PCR 的方法有相当的漏检率, 而且难以满足对大量样品的同时检测。蛋白质芯片技术的发