动物源性成分.doc

饲料中动物源性成分检测技术研究进展摘要:饲料安全与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。动物废弃物进入饲料行业曾经弥补了蛋白质饲料不足的缺口,但却带来了新的问题。饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点，适用于各种样品、基于各种原理的方法和技术被开发出来。本文以组织学特征为基础的显微镜分析方法、以蛋白质和DNA为基础的免疫学和PCR分析方法、高效液相色谱法和近红外光谱法在动物源性饲料组分中的研究应用进展等方面做了综述,并对其发展趋势进行讨论。饲料安全已与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。动物源性副产品因富含蛋白质、钙、磷等营养成分而被应用于畜禽饲料中, 但现有的证据表明, 在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或感染过痒病因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够引发和传播疯牛病( BSE)。我国于1999、2001和2004年先后下发了关于对动物源性饲料生产和管理的相关条例, 主要对反刍动物源性饲料组分、MBM、肉粉、骨粉、血粉、动物内脏干粉和动物废弃物等使用做了严格的规定。目前关于饲料中动物源性成分检测主要以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物( 如蛋白质、DNA和其他生物大分子等) 为对象, 其中PCR技术发展迅速, 已逐步被世界各国采用。但由于动物源性饲料组成上的复杂性, 单一的PCR技术仍不能克服耗时、效率低和假阳性等问题。因此,研究并建立一种( 套) 快速、灵敏、可靠的动物源性饲料检测技术, 对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控制进口饲料安全和制订相关饲料法规等均具有重要意义。本文中动物源性成分是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等，检测技术是指上述成分中蛋白质和DNA等具有种间特异性物质的物种鉴定和含量分析技术。该技术已成为保护消费者权益和安全的重要技术手段。动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的基础上。涉及的技术手段包括酶联免疫、聚合酶链式反应、电泳、色谱、生物传感分析等。本文根据分析对象对动物源性成分检测技术进行分类论述，讨论各方法的优势与局限性及其发展趋势。1. 1 以组织学为基础的检测技术 饲料显微镜分析技术主要以组织学特性为基础, 借助立体显微镜观察样品粗糙片段的形态学构造, 同时利用光学显微镜观察细小颗粒的组织学构造, 从而区分不同组织。显微镜技术以前主要用于产品品质认证( 纯度) , 能够鉴别产品混合物中植物( 如面粉、香料和饲料等产品) 或动物源性组分( 如颖苞、糊粉细胞、淀粉、血块、骨碎片、羽毛碎片、毛发、肌肉纤维等) 。BSE出现以后, 一些国家和研究机构利用饲料显微镜技术结合沉淀分析能够检测混合饲料中动物源性饲料组分, 检测精度可达0. 02% 0. 1%。该方法主要过程如下: 样品粉碎到一定的粒度后, 利用组合显微镜( 放大倍数可达400) 估计骨碎片与非骨碎片( 肌肉碎片) 的比例。大部分的骨粉碎片通过沉淀分析, 粉碎的样品悬浮在四氯乙烯中, 根据溶液的密度区分颗粒( 闻伟刚等, 2004)（闻伟刚, 赵秀玲, 等. 进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法. 农业生物技术学报, 2004, 12(2): 167169.） 。沉淀物中, 骨刺部分利用分级筛收集后称重, 最后计算动物源性组分的总重量。目前欧盟官方已将饲料显微镜分析技术作为检测动物源性饲料成分的方法, 并且制定了严格的操作规程, 可以区分反刍动物饲料中肉及肉骨粉、喷雾血粉、家禽废弃物和鱼粉( Ronaldo等, 2004)（Ronaldo L, Sanches, Juarez F, et al. Inhouse validation of amethod for detection of animal meals in ruminant feeds by microscopy. Food Control, 2004, 18.） 。低倍镜下沉淀物的一般结构和颜色是鉴别肉骨粉来源的第一信号。哺乳动物的骨碎片呈白色或淡黄色, 禽类骨碎片的颜色发暗, 这些骨碎片都是不透明的, 而鱼类骨碎片要比哺乳动物和禽类的透明。高倍镜下可以看到哺乳动物的骨碎片呈椭圆形近似圆形,根据骨碎片的品质与透明度的不同, 用导管有时也能看到, 有时环行骨板的方向也能看到。与哺乳动物相比, 禽类的骨碎片更加尖锐, 腺窝更圆, 用导管看不到。鱼类的骨呈扁平状, 其陷窝为拉长的梭形, 连成网状, 而且根据鱼的种类不同也呈现一定的多样性。这些特征是最一般的特征, 在实际的检验中变化较大。肉骨粉中会出现平滑肌或骨骼肌, 不管是哺乳动物、禽类还是鱼类, 肌肉组织一般都被破坏成短的纤维,其宽度依据处理的方法和动物的营养状况而不同。动物肌纤维一般没有各自的明显特征, 肌纤维的出现与否是判定饲料中是否出现动物源性成分的重要依据。饲料中毛发、羽毛、蛋壳、鱼刺、鱼鳃的检出可以进一步确定饲料中是否出现动物源性成分。欧盟已尝试通过饲料显微镜学方法来进行定量测定。饲料显微镜学方法具有样品制备量少、设备便宜、简单易行的优点, 但该方法费时、费力, 对技术人员的要求高, 结果与试验员的经验相关性很大。不同样品中所含有动物源性成分的来源多样, 低倍镜下颜色的重叠比较大, 高倍镜下骨陷窝的重叠性比较大。这要求显微镜分析师达到较高的专业水平。因此, 迫切需要建立一套新的、合适的鉴定标准。1 基于蛋白特异性的检测技术1.1 蛋白分子立体结构特异性基于蛋白的鉴别技术大多以蛋白分子立体结构特异性为基础，应用抗原-抗体特异性结合的原理建立，通过检测标记信号的有无或强弱来判断目标成分的有无或多少。该类技术具有操作简单、特异性好、不需要大型仪器设备的优点，容易操作，可以进行大规模检测，其核心技术是特异性抗原和抗体的筛选与制备。骨骼肌中的肌钙蛋白I(troponin I，tnI)具有高特异性和热稳定性，是理想的抗原之一，Liu等1（LIU Lihua, CHEN Furchi, DORSEY J L, et al. Sensitive monoclonalantibody-based sandwich ELISA for the detection of porcine skeletalmuscle in meat and feed productsJ. Food Science, 2006, 71(1): M1-M6.）以猪tnI为抗原制备了两种单克隆抗体Mab 8F10和Mab 5H9，Mab 8F10能够和所有的哺乳动物tnI而Mab 8F10只和猪tnI特异性反应，用该组抗体开发的抗体夹心法能够检出鸡肉和牛肉中掺杂的猪肉成分(检出限分别为0.05%和0.1%)、检出大豆蛋白基料饲料中和肉骨粉中的肉成分(检出限分别为0.05%和1%)，而且样品经过132、2h的高温处理后不影响检测效果。基于蛋白分子立体结构特异性的检测方法也有局限性，蛋白抗原决定簇的立体结构会受到多种环境因素影响而改变，当检测加工过的成分时其特异性和准确性会大打折扣，此时需要有其他手段辅助检测6（van RAAMSDONK L W D, von HOLST C, BAETEN V, et al. New developments in the detection and identification of processed animalproteins in feedsJ. Animal Feed Science and Technology, 2007, 133(1): 63-83.）1.2 蛋白或肽谱特异性基于蛋白的鉴别技术不仅仅局限于ELISA法为代表的免疫学方法，应用液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(EC)或二维电泳分析样品蛋白和短肽组成特点也能实现对样品中动物源性成分种类的识别。例如，Ashoor等7（ASHOOR S H, MONTE W C, STILES P G. Liquid chromatographicidentification of meatsJ. Journal Association of Official AnalyticalChemists, 1988, 71(2): 397-403.）开发了能够定性检测多种肉类成分和定量检测鸡肉- 火鸡肉混合物成分的LC技术。1.3 免疫学方法肉骨粉一般都要经过高温、高压处理, 在这个过程中许多蛋白质都发生了变性, 失去了抗原性和水溶性, 这就给检测带来了困难。为了使用免疫学方法鉴定动物成分的种类, 必须选择合适的动物成分作为抗原, 其中肌肉组织的蛋白质具有较高的价值。目前已发现几种热稳定的蛋白质可以作为检测的目的蛋白, 其中包括肌钙蛋白。免疫测定速度快、操作简单, 不需要对工作人员进行特殊的培训; 并且特异性高, 能特异性地检测动物肌肉, 而不与其它动物成分发生反应。ELISA 方法由于具有特异性和灵敏度高的优点, 被广泛应用于食品和饲料中的肉类品种鉴别; 并且ELISA 不需要大型的科学设备, 容易操作, 可以进行大规模的检测。2 基于DNA序列特异性的鉴别技术因此，利用DNA分子序列特异性开发定性、定量检测食品、饲料中动物源性成分的方法和技术定已成为该领域的研究焦点和主流，也是多数国家检测方法标准中指定的检测方法。2.1 DNA杂交技术Ebbehoj16 EBBEHOJ K F, THOMSEN P D. Species differentiation of heated meatproducts by DNA hybridizationJ. Meat Science, 1991, 30(3): 221-234.和Thomsen等应用32P-标记探针建立了检测生、熟牛肉中猪肉成分的DNA杂交技术，同年开发了能够区分近亲物种成分(猴和人、牛和绵羊或山羊)的条形-斑点杂交技术，检出限根据检测对象亲缘关系的远近分布在0.01%10%区间。2.2 基于PCR的动物源性成分检测技术2.2.1 PCR-电泳用物种间高异性引物对样品中的DNA进行PCR扩增后琼脂糖电泳分离，通过观察是否有特异性条带出现便可判定样品中是否含有相应的物种成分。该方法灵敏、便捷、准确，而且成本低廉，大量的具体方法和技术已被建立和开发，实现了对常见动物源性成分(单一或混合物)的快速检测。2.2.2 PCR-RFLP限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)是应用物种间同源基因上特定限制性内切酶位点特异性来实现对样品中动物源性成分来源的识别。此方法简单高效，无需设计物种特异性引物，使用适合的通用引物即可，将扩增产物进行限制内切酶反应，通过分析电泳图谱特征来判定物种来源，但该方法适合鉴别单一成分样品，多物种混合物样品由于电泳图谱较为复杂，分析难度较高，结果可靠性较低。高琳等31 高琳, 徐幸莲, 周光宏. 应用PCR-RFLP法鉴别肉制品中的猪和牛源性成分J. 南京农业大学学报, 2008, 31(2): 135-138.建立了以动物线粒体DNA中Cytb区段保守序列为靶序列的PCR-RFLP肉种检测方法，能从猪、牛、羊、鸡、鸭、兔6 种生肉及高压猪肉、猪肉火腿肠等7种热加工肉制品中鉴别出猪源性和牛源性成分。2.2.3 PCR测序该方法是将特异性PCR反应得到的扩增产物分离纯化后进行测序，并到基因组数据库(如/)进行序列比对来确定待检样品所属的物种类型，例如，Iijima等37 IIJIMA K, SUZUKI K, OZAKI K, et al. DNA analysis for identificationof food-associated foreign substancesJ. Journal of Food Quality, 2006,29(5): 531-542.建立了基于18S rRNA基因测序的食品中动植物源性成分来源分析方法，Girish等38 GIRISH P S, ANJANEYULU A S R, VISWAS K N, et al. Sequenceanalysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat speciesJ.Meat Science, 2004, 66(3): 551-556.建立了基于线粒体12S rRNA基因测序的鉴定方法。2.2.4 随机引物的扩增随机引物的扩增法(random amplified polymorphicDNA-PCR，RAPD)使用非特异性引物，能与模板上多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，经过PCR扩增反应后可产生多个PCR产物，最有效结合的引物在扩增过程中相互竞争而产生指纹，经过凝胶电泳可产生物种特异性的图谱，以此来鉴定样品中的动物源性成。RAPD的优点在于无需知道分析对象的全基因组序列，但其局限性也很突出，如只适合分析单一成分样品，而对分析多成分混合物会有一定困难。2.2.5 实时荧光PCR实时荧光PCR技术(real-time fluorescent polymerasechain reaction，RT-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程的PCR技术，并可通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术的出现使物种鉴别的灵敏性和准确性都有所提高，而且该技术无需进行电泳过程，避免了溴化乙锭等有毒染料的使用，降低了实验对人体的危险系数。其更大优势在于可通过设立外标物制作标准曲线实现对样品中特定动物源性成分(DNA)含量的绝对定量，通过分别加入特异性引物和通用引物实现特定成分的相对定量，从而实现对肉类食品中掺假成分含量的测定和掺假行为严重程度的判定。其缺点是检测成本较高，包括仪器和实验耗材。2.3 环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术56(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是一种崭新的DNA扩增方法，与普通PCR相比其最大的特点是利用具有链置换活性的DNA聚合酶(如Bacillus stearothermophilus DNApolymerase) 在65对样品中DNA进行等温扩增，而无需进行温度变化循环，具有简单、快速、特异性强的特点。Ahmed等AHMED M U, HASAN Q, HOSSAIN M M, et al. Meat species iden-tification based on the loop mediated isothermal amplification and elec-trochemical DNA sensorJ. Food Control, 2010, 21(5): 599-60557开发出了基于环介导基因恒温扩增(LAMP)和电化学芯片技术联用的动物源性成分生物传感鉴定技术，分别能检出混合样品中20.33ng/L的猪肉成分，20.33ng/L的鸡肉成分，以及78.68pg/L的牛肉成分。该技术为肉种鉴别技术小型化、便携化合自动化开辟了新的途径。LAMP法也有局限性，由于是链置换合成，不适合进行长链DNA的扩增，在产物回收鉴定、克隆、单链分离方面的表现也不如传统PCR。2.4 DNA指纹分析法DNA指纹分析法也被用于动物成分分析。动物基因组中存在大量的分散重复序列(Interspersed Repeat Sequence,IRS), 并且是种间高度特异的。Buntijer 通过用哺乳动物中广泛存在的分散重复序列的特异引物进行PCR扩增, 建立了从牛到鸵鸟的30多种哺乳动物的DNA指纹 8 Buntijer J. B. ,et al.J.Ind. Microbiol. Biotechnol. 1998,21: 121127, 这种分析产生2060个条带的图谱。实验结果表明: 用这种方法对120加热处理20min的动物肉类DNA样品进行检测所得到的指纹结果, 与对同种动物完整DNA样品进行检测得到的指纹结果相一致。4近红外光谱方法近红外光谱分析技术( Ne a r infra re d re fle c ta nc espe c trosc opy, NIRS) 是饲料界最广泛应用的技术之一,可以用于饲料中动物源性成分的检测。NIRS 的原理是饲料中的分子物质可以吸收不同波长的光线。其优点是检测快速、不用有害的试剂、所需样品量少、非破坏性检测、经济重复性好以及具有可以开发为商业化仪器的潜力; 主要缺点是这项技术是间接的检测,