研究生学位论文开题报告书—木薯低温响应膜联蛋白基因的分离及功能解析

海南大学研究生学位论文开题报告书研究生类别：博士 硕士学术学位 硕士专业学位 姓 名： 王雨晴 学 号： 13071007210003 专业名称： 遗传学 研究方向： 遗传学 导师姓名： 郭建春 入学年月： 2014年9月 填表日期： 年 月 日论文题目木薯低温响应膜联蛋白基因的分离及功能解析学位论文计划定稿时间2015年 4 月 是否与导师科研课题相关一、研究来源（1） 研究的目的和意义 植物在抗寒过程中，许多基因和蛋白质大量的表达。植物膜联蛋白（Annexin)是由多基因家族编码的型Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，它们参与植物发育的调节、生物胁迫及非生物胁迫的应答反应，并在在低温胁迫下大量表达。木薯是热带亚热带地区重要的块根作物，其本身是不耐低温的。因此本研究拟通过实时荧光定量PCR方法，分析木薯Ann基因在低温胁迫下的表达模式，筛选出响应低温胁迫的木薯Ann基因， 分离并经生物信息学分析比对，获知该基因与抗寒植物Ann基因功能结构域的差异所在。通过对木薯中Ann基因的定点突变，获得Ann基因突变转基因木薯株系，通过抗寒性试验，筛选抗寒性增强的木薯突变株系。 低温是植物生长发育及生存的关键信号因子和首要决定因素。低温胁迫是植物栽培中经常遇到的一种灾害, 涉及到粮食作物、园艺植物及其它许多经济植物。低温在很大程度上限制植物的种植范围，还会造成减产和品质下降，严重时甚至绝收。因此，植物抗寒性研究及抗寒育种成为植物学研究领域的热点之一。在植物耐寒栽培、耐寒生理、分子机制及生物技术改良等耐寒性研究中，耐寒分子机制的研究是重要的一个环节。目前分子标记技术已广泛应用于鉴定耐寒作物品种，更加有效地选育耐寒作物，改造作物，使作物自身具有更强的抵御寒冷的能力。分子生物学、生物化学和植物基因工程技术广泛应用于进一步探明植物耐寒的分子机制和发现并克隆耐寒相关基因。（2） 文献综述及评价 膜联蛋白 （annexins)是一类普遍存在于动物、植物及菌类多种生物体内的可溶性膜结合蛋白，几乎所有这些物种器官中均有表达。是在进化上保守并依赖Ca2+与磷脂、膜可逆结合的蛋白家族，这些多功能蛋白广泛分布于植物体。植物膜联蛋白在植物非生物胁迫（如：干旱、低温、盐、氧化胁迫）相关 ，膜联蛋白具有酶的功能，它可能直接参与胁迫过程中信号转导的调控6。植物膜联蛋白研究是从番茄（Slanum lycopersicum)膜联蛋白的研究开始的。在番茄基因组中至少含有9个膜联蛋白基因，分别被命名为AnnSl1AnnSl9，其基因结构、启动子顺式作用部分元件、不同器官的表达谱以及在激素(脱落酸、赤霉素)和生物胁迫(盐、干旱、损伤、热或冷)处理下的表达模式己经阐明，其表达受激素和非生物胁迫的诱导7。番茄是研究果实生物学的模式植物，已有研究表明植物膜联蛋白与果实生长和发育有关8，因此，对番茄膜联蛋白活体功能研究有助于对番前果实发育机制的进一步了解。关于膜联蛋白参与植物应对胁迫反应的第一例报道是对蒺藜苜蓿 （Medicago sativa)渗透、ABA、干旱胁迫均能使膜联蛋白 （AnxMs2)的表达上调 9。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)annexin基因家族中有8个已被分离签定，被命名为AmAt1AnnAt8，它们之间氨基酸序列同源性为29%83%，其基因表达具有组织特异性和发育阶段性，并受非生物胁迫(如:干旱、盐、冷、热、光、重金属、氧化胁迫)和激素(脱落酸、茉莉酸、乙稀、水杨酸、生长素)调节10。已报道的水稻annexin基因家族成员有10个，它们编码蛋白质的氨基酸序列之间有16-84%的同源性，分子量在32-40Kda之间，水稻膜联蛋白基因的表达也受组织特异性和发育阶段的调节，在水稻幼苗时期，其膜联蛋白基因表达还受各种非生物胁迫(盐、干旱、热和冷)的调节。通过计算模拟分析，人们预测在水稻膜联蛋白基因的上游启动子可能存在与胁迫应答相关的顺式作用元件11。在玉米中annexin基因家族成员有12个，被命名为AnnZm1AnnZm12，分子量在34.6443.12Kda之间，其基因表达具有组织特异性和发育阶段性，并受重金属（Ni、Zn、Cd)、茉莉酸、玉米黑粉病的调节12。 另外，印度芥菜(Brassica juncea)的annexin基因家族已至少分离克隆了 5个成员13；苜蓿(Metifcago)的 annexin 基因家族含有 10 个基因14。研究显示,冷胁迫能够诱导小麦和水稻膜联蛋白的积累15, 能够影响杨树叶膜联蛋白基因的表达16, 上调拟南芥膜联蛋白AnnAt1、3、4、5、7、8的表达17、18, 相比之下, 下调拟南芥膜联蛋白AnnAt2和AnnAt6的表达19。木薯因其适应性广、耐瘠薄、产量高等生物学特性成为我国热带亚热带地区非粮土地上种植的主要农作物。利用荒地、沙漠化土地等贫瘠土地种植木薯，可以在保证不与粮争地的情况下支持我国以木薯为原料的燃料酒精生产。但是木薯抗寒能力有限，作为热带亚热带作物极不耐低温20、21。解析木薯低温敏感的分子机制，可为改良木薯抗寒能力提供理论基础。（3） 主要参考资料（格式参照海南大学研究生学位论文格式规范（海研20143号）6Konopka-Postupolska, D., Clark, G., Goch, G., Debski, J., Floras, K., Cantero, A., Fijolek, B., Roux, S., Hennig, J. The role of annexin 1 in drought stress in Arabidopsis. Plant Physiology, 2009, 150: 1394-1410.7 Lu Y， Ouyang B，Zhang J， Wang T， Lu C，Han Q， Zhao S，Ye Z，Li H.Genomic organization， phylogenetic comparison and expression profiles of annexin gene family in tomato Solanum lycopersicum). Gene .2012，499:14-24.8Wilkins, M. R., Sanchez. J.C., Gooley A.A., Appel R. D., Humphery-Smith.I.,Hochstrasser D.F., Williams, K. L. Progress with proteome projects: why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it.Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 1995, 13: 19-50.9Kovacs, I., Ayaydin, F., Oberschall, A., Ipacs, I., Bottka, S., Pongor, S., Dudits, D.,Toth, E. C. Immunolocalization of a novel annexin-like protein encoded by a stress and abscisic acid responsive gene in alfalfa. Plant Journal, 1998, 15:185-197.10 Cantero A， Barthakur S， Bushart TJ， Chou S， Moian RO，Fernandez MP， Clark GB， Roux SJ ，2006，Expression profiling of the Arabidopsis annex in gene family during germination.11 Jami SK， Clark GB， Ayele BT， Roux SJ，Kirti PB，Identification and characterization of annexin gene family in rice. Plant Cell Reports ，2011，31: 813-82512 Mei-Liang Zhou .Xiong-Bang Yang ， Induction of annexin by heavy metal and jasmonic acid in Zea mays ，Funct Genomics ，2013，13:241-25113Jami, S. K., Hill, R. D., Kirti, P. B. Transcriptional regulation of annexins in indian mustard, Brassica juncea and detoxification of ROS in transgenic tobacco plants constitutively expressing AnnBj1. Plant Signaling & Behavior, 2010, 5: 618-621.14Breton, G., Vazquez-Tello, A., Danyluk, J., Sarhan, F. Two novel intrinsic annexins accumulate in wheat membranes in response to low temperature. Plant and Cell Physiology, 2000, 41: 177-184.15Hashimoto, M., Toorchi, M., Matsushita, K., Iwasaki, Y., Komatsu, S. Proteome analysis of rice root plasma membrane and detection of cold stress responsive proteins. Protein and Peptide Letters, 2009, 16: 685-697.16Renault J,Hausman J-F, Welsniewski ME (2006) Proteomics and lowtemperature studies: bridging the gap between gene expression and metabolism. Physiologia Plantarum 126:97-109.17Clark, G. B., Lee, D., Dauwalder, M., Roux, S. J. Immunolocalization and histochemical evidence for the association of two different Arabidopsis annexins with secretion during early seedling growth and development. Planta, 2005, 220:621-631.18Cantero, A., Barthakur, S., Bushart, T. J., Chou, S., Morgan, R. O., Fernandez, M. P.,Clark, G. B., Roux, S. J. Expression profiling of the Arabidopsis annexin gene Family during germination, de-etiolation and abiotic stress. Plant Physiology and Biochemistry, 2006, 44: 13-24.19Talukdar, T., Gorecka, K. M., de Carvalho-Niebel, F., Downie, J. A., Cullimore, J.,Pikula, S. Annexins: calcium- and membrane-binding proteins in the plant kingdom: potential role in nodulation and mycorrhization in Medicago truncatula. Acta Biochimica Polonica, 2009, 56: 199-210.20 张鹏， 2008，能源木薯种质资源面临的问题与解决策略 J. 生物产业技术，5:2530.21王泽平，罗兴录，孟丽萍，韦锰，周柳初，杨鑫.不同水分处理对木薯叶片生理特性的影响.广西农业科学，2010,41（5）：419-422.二、研究内容（1） 研究的主要内容 （摘要式描述）1.木薯膜联蛋白相关基因的功能分析 利用实时荧光定量PCR，进行组织器官特异表达分析、逆境时空变化分析，分析木薯该Ann基因在低温胁迫下的表达模式；2.木薯Ann基因的分离及生物信息学分析目前有关木薯膜联蛋白基因的信息还未报道，但是在很多植物中此基因已被分离出来。根据木薯基因组序列，分析预测到12个木薯Ann基因，其中有一个基因与拟南芥低温响应膜联蛋白AtAnn1基因的氨基酸序列相似性极高，我们推测该基因具有与AtAnn1基因相似的功能，可能在木薯低温响应信号途径中发挥着重要作用。本研究拟分离该基因，通过RT-PCR技术克隆获得相关基因的cDNA；通过生物信息学分析，了解其结构并预测其功能。