重庆大学---细胞生物学试验及研究方法.doc

研究生课程考核试卷（适用于课程论文、提交报告）科 目：细胞生物学实验及研究方法 教 师： 姓 名： 学 号： 专 业： 类 别： 学硕 上课时间： 年 月 至 年 月 考 生 成 绩：卷面成绩平时成绩课程综合成绩阅卷评语： 阅卷教师 (签名) 重庆大学研究生院制重庆大学生物工程学院2013级硕士生细胞生物学实验及研究方法课程考核一、现有一液氮保存中的无限肿瘤细胞株，已知其在RPMI1640培养基中生长良好。请设计实验对其生长曲线、迁移能力等相关生物学行为进行分析。答：实验设计如下： 因为细胞太小，无法测单个细胞的生长状况，所以要测细胞群体的生长曲线。细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。细胞生长曲线测定的方法有细胞计数法、MTT法等，此处分析无限肿瘤细胞株的生长曲线用细胞计数法。测细胞生长曲线具体实验步骤如下：1 取RPMI1640培养基中生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数（如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数）。2根据细胞计数结果按每个小方瓶5104/mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。324 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。4根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。细胞迁移能力的测定：1、常规消化细胞，用无胎牛血清的 DMEM 培养基洗细胞 3次，配制细胞悬液，调整浓度为5105细胞/ml，于Transwell小室的上室中加入不同的细胞悬液（MDA-MB-231/syk 、MDA-MB-231/pcDNA3.1和MDA-MB-231）200l，每组设3个复孔。2、下室加入600l含50 ml/L胎牛血清的DMEM培养基。3、37，5% CO2培养箱中孵育 2024 h。4、滤膜上的微孔允许肿瘤细胞穿越，迁移的细胞可黏附于膜下层，取出Transwell 小室，用 PBS 洗2遍，棉拭子擦去膜上面未迁移的细胞，计数并比较穿过膜的细胞数，可在一定程度上反应肿瘤细胞的迁移能力。5、细胞显色：95%乙醇固定Transwell小室上的聚碳酸酯滤膜30min，PBS冲洗2 次，每次3 min，自来水冲洗121%盐酸酒精分化数秒钟，自来水冲洗12 min伊红染色 80 s，自来水冲洗，梯度乙醇脱水：70%乙醇 10 s，80%乙醇 10 s，90%乙醇 1 min，95%乙醇 1 min，无水乙醇 将滤膜撕下来，有细胞的一面向上放在载玻片上，加盖玻片，中性树脂封片在400倍高倍镜下记数，每张片子随机记录5个视野的迁移细胞数，将5个数值加起来表示细胞迁移数。细胞侵袭能力的测定：1、基质胶的准备：将冻存于-20冰箱的 Matrigel 胶 4放置过夜，变成液态。并预冷枪头。2、用 400 l 无胎牛血清 DMEM 培养基稀释50l Matrigel胶原液（1:8稀释），混匀（冰上操作）。向 Transwell 小室的上室中分别加入50l 稀释液，放入37培养箱中孵育45h，此间经常观察，当出现“白色层”时，说明 Matrigel 胶已变为固态。3、加100l无血清培养基浸润凝固的胶，吸弃，后续步骤与迁移实验相同。通过计数穿膜细胞数来反应细胞的侵袭能力。（还有细胞的粘附、增殖、分化等生物学行为）二、相关研究提示间充质干细胞（MSCs）在某种刺激条件下碱性磷酸酶（ALP）的表达会发生变化。现有足够数量经过该条件刺激的MSCs和没有经过刺激的对照MSCs，请你设计实验验证该刺激条件下MSCs上ALP在mRNA和蛋白水平的表达变化。答：经刺激的间充质干细胞（MSCs）和未被刺激的间充质干细胞（MSCs）其碱性磷酸酶的表达量发生变化。下面我将设计实验分别从mRNA和蛋白水平验证这一刺激是否引起碱性磷酸酶表达量的变化。首先从mRNA水平验证碱性磷酸酶在被刺激的间充质干细胞中的表达与未被刺激的间充质干细胞相比发生变化。先提取总RNA，再从中获取mRNA，之后反转录，用荧光定量PCR检测其表达量。对这两份细胞分别做相同的实验，分别测定被刺激和未被刺激的间充质干细胞中ALP的mRNA的表达量，根据实时定量PCR的结果比较间充质干细胞被刺激后其碱性磷酸酶mRNA的表达量是否发生变化。从蛋白水平验证碱性磷酸酶在被刺激的间充质干细胞中的表达与未被刺激的间充质干细胞相比发生变化。用Gomori染色法（用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性）检测细胞中骨型碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase BALP）的含量，具体步骤如下：1、将无菌玻片放在细胞的培养皿中，待细胞生长至半汇合后取出。也可以选择直接在培养皿或培养板中染色，此时就不需要放入无菌玻片了；2、PBS冲洗后用冷丙酮固定10min，固定后再用PBS冲洗3次。也可以选择用95%的乙醇或者甲醛固定，固定时最好放在4的条件下；3、配制孵育液：3%beta-甘油酸钠：5ml；2%巴比妥钠：5ml；2%CaCl2：10ml；2%MgSO4：1ml；蒸馏水：10ml；4、入孵育液中，37，孵育4-6小时，PBS冲洗3次；5、2%硝酸钴浸泡5min，PBS冲洗3次；6、1%硫化铵浸泡2min，PBS冲洗3次，自然干燥，封固；7、镜下观察染色结果。（用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，此方法法以天然存在的-甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴,最终产物为黑色硫化钴沉淀）所以胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或者块状沉淀，黑色块状沉淀能反应细胞中ALP的含量。注意事项：1、冲洗时应该间接冲洗，如果是玻片就在玻片周边的液体中用吸管吸打，间接冲洗，培养皿或培养板就用枪头在培养皿或培养板周边缓慢吹打，这样细胞就不容易脱片或是吹打掉。2、硝酸钴带6个水，硫酸铵带7个水，称重时不用去掉水的重量，直接称量。1%硫化铵直接用原液配成1%的溶液，原液当作100%，不用按硫来计算。三、某实验室合成了一种水溶性的抗肿瘤药物A，欲在细胞水平上检测其药效，拟以人肝癌细胞HepG2为研究对象评价A药物的抗肿瘤效果。请设计相关实验方案并简要说明其原理。答：评价药物A抑制肿瘤效果，实验设计具体步骤如下：细胞铺板：选择处于对数生长期的细胞,倒去培养液，Hanks液冲洗，加胰蛋白酶消化13min弃去胰蛋白酶,加入适量DMEM培养基，终止消化，镜检计算细胞浓度，加入相应量培养基 , 制成5104mL的细胞悬液，加细胞悬液至96孔板中，200L/孔，移入37CO2培养箱培养24 h。细胞给药：用PBS溶解药物A，制成储备液，以DMEM培养基稀释储备液，得到一系列浓度的药物；96孔板弃去原液，每孔先加入100LDMEM培养基，再加入100L稀释后的药物溶液，板上终浓度为1、3、10、15、30、45、60、120、180、240、300、360、420g/ml，每个浓度设3个复孔，以不加药组为空白对照；加药完毕后移入37CO2培养箱培养。检测方法：给药48h后，弃去孔内液体，加DMEM培养基190L/孔和MTT（5mg/ml）10L/孔。375CO2培养箱中温孵4h后，弃板上各孔内原有液体，加DMSO200L/孔以溶解甲臜沉淀。室温置30min后，用酶标仪在570nm波长下测定各孔光密度值（OD）。计算药物抑制率：药物抑制率=1实验组光密度值/对照组光密度值100,以药物抑制率对浓度作图，绘制药物A对肝癌细胞 HepG2的抑制曲线。从所绘制的曲线分析药物A对人肝癌细胞的抑制效果。实验原理：MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还