转基因鉴定与安全性评估.ppt

三 转基因的检测 一 遗传标记法 在表达载体中安装选择性基因如对某种抗生素的抗性基因 对某种除草剂的抗性基因等在表达载体中安装报告基因转化处理过的受体在相同条件下都能生长 但转化体具有非转化体所不具有的某种特殊表现 称为显性的报告基因 或者转化体不具有非转化体的表现 称为隐性的报告基因 1 利用选择性基因 筛选植物转化细胞或转化植株常用的选择剂 抗生素类有卡那霉素 潮霉素B等 除草剂类有草甘膦 双丙氨膦 绿黄隆等 检测潮霉素抗性的叶片放入含一定体积 约30rn1 检测溶液的平皿中 在12h光照 12h黑暗 26 条件下培养 定期观察叶片变色情况 以判断其抗性水平 检测溶液为含1mg L苄氨基嘌呤 6 BA 及100mg L潮霉素B的水溶液 浸种培养至破胸时 分放在装有不同浓度G418溶液的培养皿中 培养皿底覆盖有两层滤纸 将培养皿置于光照培养箱内 光强为10 000 mol m2 s 光照时间为12h d 温度为29 观察种子发芽情况 7d后统计其发芽率和白化死亡率 每片叶剪成2cm左右长的叶段放入装有G418的培养皿中 将叶片置于室内室温下 光强约为10 000 mol m2 s 光照时间约为12h d 温度约为25 定期观察其变化情况 300mg l 80mg l 浸泡种子 浸泡幼苗叶片 喷施幼苗 2 利用报告基因gus基因 萤火虫荧光素酶基因等 应用较为广泛的是gus基因 即 葡糖苷酸酶基因 gus基因来自细菌 所编码的 葡糖苷酸酶 与5 溴 4 氯 3 吲哚 D葡糖苷酸酯 简称为X Gluc 的底物发生作用时 能产生蓝色沉淀反应 既可用分光光度计测定 又可直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点 转基因愈伤组织的GUS显色 GFP GreenFluorescenceProtein GFP395nm 470nm505nmYFP527nmCFP433nm476nm 激发波长 发射波长 马丁 沙尔菲 下村修 钱永健 2008年诺贝尔化学奖 cyanfluorescentprotein yellowfluorescentprotein 二 分子生物学方法检测 1 DNA水平 1 PCR CK 转基因个体 模板template引物primerdNTPTaq反应缓冲液 离子Mg2 等 1 DNA变性 90 96 双链DNA模板在热作用下 氢键断裂 形成单链DNA 2 退火 25 65 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部双链 3 延伸 70 75 在Taq酶 在72 左右最佳的活性 的作用下 以dNTP为原料 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板互补的DNA链 现在有些PCR因为扩增区很短 即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成 因此可以改为两步法 即退火和延伸同时在60 65 间进行 以减少一次升降温过程 提高了反应速度 gDNA提取方法 CTAB法 SDS法 1 DNAextractionbuffer finalconcentration0 35Msorbitol63 75gsorbitol S29 山梨醇0 1MTris200mlof1MTris pH7 55mMEDTA Na210ml0 5MEDTAadddistillH2Oto1literAdjustpHto7 5withHCL 2 Nucleilysisbuffer finalconcentration0 2MTris200mlof1MTris pH7 550mMEDTA Na2100ml0 5MEDTA2 0MNaCl117gNaCl S13 2 CTAB20gCTAB C11 十六烷基三甲基溴化铵adddistillH2Oto1liter 3 5 sarkosyl 50gperliterofN lauroylsarcosinesodiumsalt L1 Prepareextractionbuffer 1vol DNAextractionbuffer 1vol Nucleilysisbufferand0 4vol 5 sarkosyl Beforeuse addNa bissulfitetoaconcentrationof0 02M 3 8g L Mixgently warmupto65 iftooviscous CTAB 1 取材料 加液氮研磨成粉末状 迅速移入1 5mlEppendorf管中 2 加入800 l的CTAB提取缓冲液 混匀 CTAB在65 水浴预热 每5min轻轻震荡几次 20min后12000r min 离心15min 3 小心吸取上清液 加入等体积的酚 氯仿 各400 l 溶液 混匀 4 12000r min 离心10min 4 小心吸取上清液 加入等体积的氯仿 混匀 4 12000r min 离心10min 5 重复步骤 4 1 2次 以蛋白层不出现为止 6 取上清 20 沉淀1h 4 12000r min 离心10min 7 弃去上清液 用70 乙醇洗涤沉淀2次 8 室温下干燥后 一般干燥5 15min 溶于30 50 l去离子水中 于 20 或者 70 下保存备用 SDS方法提取gDNA 研磨的组织细胞用热的SDS裂解后 加入高浓度的KAc 0 放置以除去蛋白和多糖类杂质 最后用乙醇或异丙醇沉淀 1 取幼嫩的组织材料1 2g 加入液氮研磨至粉末状 加500 L提取液的离心管中 轻轻混匀 2向管中加入50 L20 SDS溶液 混匀 不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 65 保温10min 并不时摇动 3加入150 L5mol LKAc 混匀 置冰上20 30min 44 15000rpm离心15min 转移上清到另一离心管中 加入0 7V的异丙醇 混匀 20 沉淀30min 512000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀 吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA 6加入1 10体积的RNaseA 37 保温20min 除去RNA 7氯仿抽提后 加2V乙醇 20 沉淀30min 12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀 8用400 L70 乙醇洗一次后 吹干 加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA 2 核酸分子杂交法 核酸杂交 探针 同位素标记等样品 转印好的膜温度 65 缓冲液 SSC鲑鱼精DNA 扣除非特异杂交背景 一 提取基因组总DNA二 基因组DNA的限制酶切根据实验目的决定酶切DNA的量 一般Southern杂交每一个电泳通道需要10 30 g的DNA 三 基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法 制备简单 分离范围广 200bp 50kb 实验成本低 1 制备0 8 凝胶 一般用于Southern杂交的电泳胶取0 8 2 电泳 电泳样品中加入6 Loading缓冲液 混匀后上样 留一或两泳道加DNAMarker 1 2V cm DNA从负极泳向正极 四 DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物 一 试剂准备 变性液 0 5MNaOH 1 5MNaCl 中和液 1MTris HCl pH7 4 1 5MNaCl 转移液 20 SSC NaCl175 3g 柠檬酸三钠82 2g NaOH调pH至7 0 加ddH2O至1000ml 二 操作步骤1 碱变性 室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min 2 中和 将凝胶转移到中和液15min 3 转移 转移液用20 SSC 注意在膜与胶之间不能有气泡 整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物 4 转移结束后取出NC膜 浸入6 SSC溶液数min 洗去膜上沾染的凝胶颗粒 置于两张滤纸之间 80 C烘2hr 然后将NC膜夹在两层滤纸间 保存于干燥处 五 探针标记进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记 探针的标记方法有随机引物法 切口平移法和末端标记法 有一些试剂盒可供选择 操作也很简单 以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤 1 取25 50ng模板DNA于0 5ml离心管中 100 变性5min 立即置冰浴 2 在另一个0 5ml离心管中加入 Labeling5 buffer10 l 含有随机引物 dNTPmix2 l 含dCTP dGTP dTTP各0 5mM BSA 小牛血清白蛋白 2 l a 32P dATP3 lKlenow酶5U3 将变性模板DNA加入到上管中 加ddH2O至50 l 混匀 室温或37 1hr 4 加50 l终止缓冲液终止反应 六 Southern杂交一般采取的是液 固杂交方式 即探针为液相 被杂交DNA为固相 1 预杂交NC膜浸入2 SSC中5min 在杂交瓶中加入杂交液 8cm 8cm的膜加5ml即可 将膜的背面贴紧杂交瓶壁 正面朝向杂交液 放入42 杂交炉中 使杂交体系升到65 取经超声粉碎的鲑鱼精DNA 已溶解在水或TE中 100 加热变性5min 迅速加到杂交瓶中 使其浓度达到100 g ml 继续杂交4hr 鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点 降低杂交背景 提高杂交特异性 2 杂交倒出预杂交的杂交液 换入等量新的已升温至42 的杂交液 同样加入变性的鲑鱼精DNA 将探针100 加热5min 使其变性 迅速加到杂交瓶中 42 杂交过夜 七 洗膜与检测SSC和SDS 利用SouthernBlot检测目的基因拷贝数 2 RNA转录水平 RT PCR和Q PCR检测 mRNA cDNA PCR 蛋白水平 翻译水平 是利用抗原 抗体特异结合原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成 是将蛋白质电泳 印迹 免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法 WesternBlot详细过程 蛋白提取SDS PAGE电泳转膜杂交过程显示结果 NBT BCIP碱性磷酸酶标记DAB辣根过氧化酶标记荧光扫描仪 电泳示意图 返回 返回 WesternBlot步棸 封闭 Blocking 转膜完毕后 立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中 漂洗1 2分钟 以洗去膜上的转膜液 加入Western封闭液 在摇床上缓慢摇动 室温封闭60分钟 对于一些背景较高的抗体可以在4 封闭过夜 一抗孵育 Primaryantibodyincubation 参考一抗的说明书 按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗 加入稀释好的一抗 室温或4 在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时 或者在4 缓慢摇动孵育过夜 洗涤3次 二抗孵育 Secondaryantibodyinucubation 参考二抗的说明书 按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶 HRP 标记的二抗 加入稀释好的二抗 室温或4 在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时 洗涤3次蛋白检测 Detectionofproteins 参考相关说明书 使用BeyoECL Western荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白 洗片时可以使用X光片自动洗片机 如果没有自动洗片机 可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片 转化当代的外源基因整合和表达表型证据分子生物学证据转基因生物的完整鉴定还需要提供以下证据转化体当代性状表现的证据 如抗虫 抗病等 转化体表型性状遗传的证据有性繁殖作物应能传递到后代无性繁殖作物繁殖一代应稳定遗传以上各方面均要求设置严格的对照 转基因的遗传 一 转基因的整合位点和拷贝数对其功能表达及遗传的影响 二 转基因遗传稳定性 三 转基因在转化植株中的遗传传递规律 四 转化方法对整合的外源基因结构及遗传特性的影响 转基因整合特点转基因整合的遗传效应转基因沉默 一 转基因的整合位点和拷贝数对其功能表达及遗传的影响 转基因整合的遗传效应 位置效应外源基因插入拷贝数相同但由于插入位置不同而造成该基因表达量不同的现象称为位置效应同源基因的共抑制效应插入的外源基因与植物基因组内部的产生基因同源共抑制效应插入的外源基因之间的同源共抑制效应外源基因重排同源基因的异位配对造成寄主染色体重排 转基因沉默 位置效应基因及启动子的甲基化重复序列诱导的基因沉默同源基因的共抑制效应 甲基化导致基因沉默 甲基化当一个或多拷贝基因整合进入或接近高甲基化基因组序列时 转基因的顺式失活就可能发生 1 植物中的甲基化可以进行传递 当甲基化传递进转基因中时 就会导致基因沉默 2 多拷贝基因整合进一个甲基化位点时也能产生顺式转录沉默 重复诱导失活 3 有时转基因以单拷贝插入一个高甲基化位点也能引起转录基因沉默 总的来说甲基化 或超甲基化 和染色质凝集 异染色质化 是与转录基因沉默相关联的普遍特征 重复序列诱导基因沉默 外源基因多拷贝形式整合到同一位点重复序列自发配对甲基化酶特异识别这种配对结构进而使其甲基化 或异染色质化相关蛋白识别重复序列间配对形成的拓扑结构 同源基因的共抑制效应 共抑制是指在外源基因沉默的同时 与其同源的内源DNA的表达也受到抑制 转录后基因沉默 PTGS 转录后基因沉默 转录能进行但mRNA不能积累而发生的基因沉默 它也可分为转录后顺式失活和转录后反式失活 共抑制 PTGS在单倍体和纯合体中发生的概率较杂合体要高 表现出基因剂量效应 使用双增强子的35s启动子比使用经典的35s启动子发生PTGS的频率要高 根据前人的研究结果 Dehio和Schell提出了PTGS可能的分子机制 阈值假说 thresholdhypothesis PTGS是因为转基因RNA的过量产生造成的 当RNA超过了一定的阈值水平 通过RNA RNA相互作用和 或反义RNA cRNA 引发mRNA的不可逆降解 二 转基因的遗传稳定性 减数分裂配子形成过程中丢失外源DNA是在细胞质基因组中整合配子中外源DNA引起致死突变外源基因插入引起的基因重排 丢失外源DNA的共抑制效应及甲基化使基因失活 三 转基因的遗传规律 单位点插入孟德尔单基因遗传规律多位点插入较为复杂 四 转化方法对整合的外源基因结构及遗传特性的影响 农杆菌侵染方法T DNA串联 T DNA截短直接转化DNA的方法发生DNA环化甲基化 片段分离以及丢失和重排等已经整合到基因组中的能稳定遗传 转基因的安全性及安全评价 转基因食品安全吗 面对转基因技术的争议 转基因为人类带来的利益和风险 我们的路该怎样走 对转基因作物的安全性争论 国际上有几个典型的事件 Pusztai事件 英国Rowett研究所有位Pusztai博士 他用转雪花莲凝集素基因的土豆喂大鼠 1998年秋天在英国电视台发表讲话 声称大鼠食用了这种土豆后 体重和器官重量减轻 免疫系统受到了破坏 后果 绿色和平组织 地球之友等反生物技术组织把这种土豆说成 杀手 并策划了破坏转基因作物试验地等行动 焚烧了印度的两块试验田 甚至美国加州大学戴维斯分校的非转基因试验材料也遭破坏 以致研究生毕业论文都无法如期完成 英国皇家学会组织了同行评审 并于1999年 月发表评论 指出Pusztai的试验有六方面的错误 不能确定转基因和非转基因马铃薯的化学成分有差异 对食用转基因土豆的大鼠 未补充蛋白质以防止饥饿 供试动物数量少 饲喂几种不同的食物 且都不是大鼠的标准食物 缺少统计学意义 试验设计差 统计方法不当 试验结果无一致性等 斑蝶事件 1999年5月 康奈尔大学的一个研究组在 Nature 杂志上发表文章 声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫 马利筋 的杂草上 用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶 导致44 的幼虫死亡 这一实验结果在科学上没有说服力 玉米的花粉非常重 扩散不远 在玉米地以外 米 马利筋叶片 CM2上只找到一个玉米花粉 2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明 抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁 实验室试验中用 倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫 也没有发现对其生长发育有影响 斑蝶减少的真正原因 一是农药的过度使用 二是墨西哥生态环境的破坏 加拿大 超级杂草 事件 由于基因漂流 在加拿大油菜地里发现了个别油菜植株可以抗一种 两种或三种除草剂 因而有人称此为 超级杂草 并怪罪于转基因 基因漂流并不是从转基因作物开始 如果没有基因漂流 就不会有进化 世界上也就不会有这么多种的植物和现在的作物栽培品种 举例来说 小麦由 三个基因组组成 它是由分别带有 基因组的野生种经过基因漂流合成的 所以 以此来禁止转基因作物 也是没有道理的 中国 t抗虫棉破坏环境事件 2002年6月3日 南京环科所与绿色和平组织在北京召开会议 月 日 Chinadaily 上发表了题为 GMCottonDamageEnviroment 的文章 当天 绿色和平组织在其网站上刊登了南京环科所 绿色和平组织顾问薛达元先生长达26页的英文报告 从而再次引发国际争论 在欧 美产生巨大反响 月 日德国 农业报 发表了题为 中国研究 棉破坏环境巨大 绿色和平组织的 中国项目主管 声称 棉农将面对不受控制的超级害虫 转基因抗虫棉不但没有解决问题 反而制造了更多的问题 棉农将被迫使用更多 更毒的农药 事实上 抗虫棉在中国实践多年 深受广大棉农的欢迎 中国 美国 德国 加拿大 比利时 印度等国的科学家已在网上纷纷发表评论 反驳绿色和平组织的观点 转基因玉米危害肾脏健康 2010 1 289 22 00 成立于1901年的农业公司孟山都曾对三种类型的转基因玉米进行了毒性研究 但一直拒绝公开研究数据及结论 最近孟山都公司迫于压力公开其研究结果以及相关数据 针对此数据与结果分析 试验用的转基因玉米会造成对使用者肝脏 肾脏不同程度的损害 但该结论还未得到官方机构和毒理学家的认可 转基因生物的安全性 这些报道大多在后期被科学界或相关权威机构从方法或结果验证上予以否定 目前依然存在一些其他的有关转基因农作物存在生物安全性的报道 对这些报道 国际权威机构或主流科学界尚未认同 另外 有些关于转基因生物是否安全的争论则脱离了科学本身 而是与政治 国际贸易和宗教信仰等有关 转基因 GMO 食品三类 GM植物 动物和微生物食品农业基因工程 强调提高农作物产量和改善农作物的抗虫性 抗病性 抗除草剂和抗旱能力食品基因工程 强调改善食品的营养价值和食用风味 如营养素含量 风味品质 延长食品储藏和保存时间 以及用食品工程菌生产食品添加剂和功能因子等安全性 环境安全 如插入基因的漂移 抗虫性 抗除草性食用安全 如插入基因后的终产物的致癌性 致病性 过敏性 毒性 GeneticallyModifiedOrganism 一 转基因食品的食用安全性问题 对终产物 已知或未知的终产物 的影响 转移的基因结构的稳定性 基因插入受体基因组的位置 载体的选择以及使用具有抗生素耐药性的选择性标记基因是否会对人产生影响 引起机体过敏等 大豆蛋白 食品安全性评价原则 经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则 如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性 则可以认为是安全的 如转病毒外壳蛋白基因的抗病毒植物及其产品与田间感染病毒的植物生产的产品都带有外壳蛋白 这类产品应该认为是安全的 若转基因植物生产的产品与传统产品不存在实质等同性 则应进行严格的安全性评价 食品安全 有毒物质 必须确保转入外源基因或基因产物对人畜无毒 如转Bt杀虫基因玉米除含有Bt杀虫蛋白外 与传统玉米在营养物质含量等方面具有实质等同性 要评价它作为饲料或食品的安全性 则应集中研究Bt蛋白对人畜的安全性 目前已有大量的实验数据证明 Bt蛋白只对少数目标昆虫有毒 对人畜绝对安全 食品安全 过敏源 在自然条件下存在着许多过敏源 在基因工程中如果将过敏源基因转入新的植物中 则会对过敏人群造成不利的影响 转入过敏源基因的植物不能批准商品化 如美国有人将巴西坚果中的2 S 清蛋白基因转入大豆 虽然使大豆的含硫氨基酸增加 但也未获批准进入商品化生产 因为有人对它过敏 二 转基因农作物环境安全 环境安全性评价核心问题 基因植物释放到田间去是否会将基因转移到野生植物中 或是否会破坏自然生态环境 打破原有生物种群的动态平衡 环境安全性包括 转基因植物演变成农田杂草的可能性基因漂流到近缘野生种的可能性对自然生物类群的影响 转基因植物演变成农田杂草的可能性 植物在获得新的基因后会不会增加其生存竞争性 在生长势 越冬性 种子产量和生活力等方面是否比非转基因植株强 若转基因植物可以在自然生态条件下生存 势必会改变自然的生物种群 打破生态平衡 从目前在水稻 玉米 棉花 马铃薯 亚麻 芦笋等转基因植物的田间试验结果来看 转基因植物在生长势 越冬能力等方面并不比非转基因植株强 也就是说大多数转基因植物的生存竞争力并没有增加 故一般不会演变为农田杂草 环境安全 基因漂流 转移的外源基因漂移到近缘野生种的可能性 在自然生态条件下 有些栽培植物会和周围生长的近缘野生种发生天然杂交 从而将栽培植物中的基因转入野生种中 若在这些地区种植转基因植物 则转入基因可以漂流到野生种中 并在野生近缘种中传播 基因漂流到近缘野生种的可能性 在进行转基因植物安全性评价时 应从两个方面考虑这一问题 一个是转基因植物释放区没有存在与其可以杂交的近缘野生种 则基因漂流就不会发生 如在加拿大种植转基因棉花 因没有近缘野生种存在则不可能发生基因转移 在中国种植转基因玉米 因没有野生大刍草 所以也不会发生基因漂流 基因漂流到近缘野生种的可能性 另一个可能是存在近缘野生种 基因可从栽培植物转移到野生种中 这时就要分析考虑基因转移后会有什么效果 如果是一个抗除草剂基因 发生基因漂流后会使野生杂草获得抗性 从而增加杂草控制的难度 特别是若多个抗除草剂基因同时转入一个野生种 则会带来灾难 若是品质相关基因等转入野生种 由于不能增加野生种的生存竞争力 所以影响也不大 对自然生物类群的影响 在植物基因工程中所用的许多基因是与抗虫或抗病性有关的 其直接作用对象是生物 如转入Bt杀虫基因的抗虫棉 其目标昆虫是棉铃虫和红铃虫等植物害虫 如大面积和长期使用 昆虫有可能对抗虫棉产生适应性或抗性 这不仅会使抗虫棉的应用受到影响 而且会影响Bt农药制剂的防虫效果 解决办法 在抗虫棉推广时一般要求种植一定比例的非抗虫棉 以延缓昆虫产生抗性 对自然生物类群的影响 除了目标昆虫外 我们还要考虑转基因植物对非靶昆虫的影响 如有人用Bt蛋白饲料喂棉田中6种非靶昆虫 当杀虫蛋白浓度高于控制目标昆虫浓度100倍时 对非靶昆虫均未出现可见的生长抑制 另外 Bt蛋白对有益昆虫如蜜蜂 瓢虫等都无毒性 按照对人类 动植物 微生物和生态环境的危险程度 划分以下四个等级 安全等级 尚不存在危险 安全等级 具有低度危险 安全等级 具有中度危险 安全等级 具有高度危险 农业转基因生物安全评价和安全等级的确定按以下步骤进行 1 确定受体生物的安全等级 2 确定基因操作对受体生物安全等级影响的类型 3 确定转基因生物的安全等级 4 确定生产 加工活动对转基因生物安全性的影响 5 确定转基因产品的安全等级 转基因生物的安全评价 转基因生物安全评估分为5个阶段 实验研究 中间试验 环境释放 生产性试验和申请安全证书 通过实验研究获得转基因生物体后 需要向国务院行政主管部门申请并被批准后才能转入下一试验阶段的安全性评估 中间试验 指在控制系统内或者控制条件下进行的小规模试验 报告中间试验一般应当提供以下相关附件资料 1 目的基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列 2 目的基因与载体构建的图谱 3 试验地点的位置图和试验隔离图 4 试验设计 包括安全评价的主要指标和研究方法等 如转基因微生物的稳定性 竞争性 生存适应能力 外源基因在靶动物体内的表达和消长关系等 5 实验室研究阶段的总结报告 环境释放 指在自然条件下采取相应安全措施所进行的中规模的试验 申请环境释放试验除了中间试验所涉及的相关资料外 还需要提交中间试验阶段的安全性评价试验总结报告和毒理学试验报告 如急性 亚急性 慢性实验 致突变 致畸变试验等 生产性试验 指在生产和应用前进行的较大规模的试验 申请生产性试验除了环境释放试验所涉及的相关资料外 还需要提交环境释放安全性评价试验的总结报告和目的基因或动物用转基因微生物向环境中的转移情况报告 安全证书 生产应用 在生产性试验结束后 可以向国务院行政主管部门申请转基因生物安全证书 在综合之前各阶段研究的基础上 还需补充目的基因的分子检测或鉴定技术方案 重组DNA分子的结构和构建方法 转基因微生物的稳定性 生存竞争性 适应能力等的综合评价报告 对非靶标生物影响的报告以及该类动物用转基因微生物在国内外生产应用的概况等 发放转基因生物安全证书并不等同于允许商业化生产 按照 农业转基因生物安全管理条例 中华人民共和国种子法 和 主要农作物品种审定办法 等法律法规规定 转基因产品 如农作物 获得安全证书后 还要根据国家品种审定法规的规定 首先进行严格的区域试验和生产试验 达到标准的才可获得品种审定证书 需要特别指出的是 转基因粮油等主要作物的品种审定不同于普通作物品种审定 有关区域试验和生产试验必须在严格可控的条件下进行 三 转基因食品的安全评价 1 转基因食品的检测技术外来基因或DNA外来的蛋白质2 对