生化技术总结.doc

第一章 提取与沉淀分离1、 细胞破碎的方法主要有：机械破碎法； 物理破碎法（溶胀和自溶）；化学破碎法：如丙酮、氯仿、甲苯、SDS； 生物酶降解。2、提取：是在分离纯化前期，将样品研磨，把被破碎的细胞置于一定的溶剂（提取液）中，使某一类分子目的物释放到提取液中的过程。3、提取液应具备的条件：对有效成分溶解度大，破坏作用小；对杂质溶解度小或不溶解；来源广泛、价格低廉、操作安全等。4、溶剂提取法： 1）原理：利用溶剂的溶解作用把所需物质从细胞中转移出来。 2）影响溶剂提取的因素：a、溶剂的性质：（根据相似相溶原理） b、离子强度：离子强度是影响物质溶解度的主要因素，但离子强度对不同物质溶解度的影响不同，如高离子强度下DNA-核蛋白溶解度增加，而低离子强度下RNA-核蛋白溶解度增加；绝大多数蛋白质和酶，在稀盐溶液中溶解度增加（盐溶）。c、PH值：溶剂的PH值影响溶质分子的解离状态，离子状态的物质，不能是阳离子还是阴离子都易溶于水，而非离子状态的物质易溶于有机溶剂。 d、温度：温度的升高可以增加物质的溶解度。 e、去垢剂：去垢剂是一类既有亲水基又有疏水基的物质，可以分为阴离子、阳离子和中性去垢剂等，如SDS，Tween20，Triton X-100。5、盐析沉淀法：1）概念：盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。 2）原理：根据蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随着盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出。3）影响蛋白质盐析因素（主要四个）：a蛋白质浓度对盐析的影响：蛋白质浓度过大，盐析时发生共沉现象，分离效果不好；蛋白质浓度太稀，耗盐量过大，蛋白质回收率也低。一般为2.5%-3.0%的蛋白质浓度较适中。b离子强度和离子类型对盐析的影响：离子强度越大，蛋白质的溶解度越低，越容易产生盐析现象；离子半径小而价数高的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而价数低的离子对盐析影响弱。 c对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将值调到蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。d . 温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在-操作。4）盐析时的注意事项 ： （1）添加的硫酸铵的纯度要高，添加后，要放30min以上使其充分溶解，且要不断搅拌，防止局部过浓，发生共沉淀； （2）同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析的方法。盐析通常与等电点沉淀法配合使用。 （3）选择好温度，一般在室温下进行； （4）蛋白浓度不易过高，一般2530g/L；低浓度盐析，可用离心分离；高浓度盐析（7080），用过滤（因为粘度大，离心操作慢）；盐析沉淀得到的蛋白质含量较高，纯品需经脱盐处理，如透析，凝胶过滤等。 第二章 层析分离技术1、层析技术： 1）概念：层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，而达到分离的技术。 2）基本原理：层析系统都由两个相组成：固定相：它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。流动相：即可以流动的物质。在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。3）分类（按分离原理）： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。2、吸附层析：1）原理：它是利用混合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小及分子极性等），使各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时，由于吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。 2）过程：a 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相；b 选择合适的吸附剂；c 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数d 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物。 3）影响吸附分离效果的因素（考）：A 吸附剂的性质； B 洗脱剂的性质； C 层析柱及装填技术;D 对样品的要求; E 加样方式及加样量; F 柱效。 4）吸附剂选择原则：选择性好：对不同物质的吸附力差异性大； 表面积大：增加吸附容量； 性质稳定：不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破碎。颗粒均匀、表面积大；成本低廉 。 5）洗脱剂选择原则：性质稳定：不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩； 纯度高：防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形成的污染； 能较完全洗脱下所分离的成分； 低粘度：高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降低效率； 样品容易回收； 无吸收背景：提高检测的灵敏度。3、离子交换层析：（选择题） 1）概念：利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。2）原理：离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基因以共价键连接，电荷基因与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，假设以RA+代表阳离子交换剂，其中A+为反离子，A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应，反应式为：RA+B+ RB+A+ 4、凝胶层析（分子排阻）： 1）概念：又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。2）基本原理：凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。分配系统Ka来量度： Ka=(Ve-Vo)/Vi Ve：为洗脱体积，表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时，所需的洗脱液体积；Vo：外体积，为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积；Vi：内体积，为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 3）洗脱的三种可能：Ve=Vo 该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。ViVe-Vo 该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低一般物质的Kd值是0Kd l。 5、亲和层析： 1）概念：利用生物分子与配体之间所具有的专一而可逆的亲和力，使酶等生物分子分离纯化的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体，酶RNA 互补的RNA分子或片段，RNA与互补的DNA分子或片段等之间。 2）分离原理：通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 3）亲和层析所用基质（4点）：可被应用的基质（载体）：（按性能优劣排序）琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10Bl 具有较好的物理化学稳定性l 能够和配体稳定的结合l 结构为均匀的多孔网状结构l 与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附 要使不溶的母体与配基偶联或通过连接臂与配基偶联，都必须进行母体活化。溴化氰活化、环氧乙烷基活化 。4）配体的选择：l 与待分离的物质有适当的亲和力l 与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性l 与基质稳定的共价结合l 自身应具有较好的稳定性 配体分为：l 特异性配体：只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体，抗原和抗体、酶和它的抑制剂。l 通用性配体：特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体。凝集素可以结合各种糖蛋白 。5）基本操作过程：选择适当的配体将配体固定化到基质上将目的蛋白混合液加样到基质上除去非特异性结合的蛋白质洗脱纯的目的蛋白 第三章 离心分离技术1、 离心分离 1）概念：借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。2）影响因素：离心力（转速） 离心时间 温度 pH值 3）分类： A 低速离心 B 高速离心C 超速离心：a、差速离心：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。b、密度梯度离心：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的一种区带分离方法。（与沉降系数有关，与密度无关）c、等密度梯度离心：指当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力作用下，颗粒或向下沉降或向上浮起，一直沿梯度移动到与其密度恰好相等的位置上（即等密度点），形成区带而分离的方法。 第五章 电泳技术1、电泳： 1）概念：带电粒子在电场中向着与本身所带电荷相反的电极移动的过程。 2）影响因素：a、电场强度； b、溶液的PH； c、离子强度； d、电渗现象； e、温度； f、支持物。2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： （1）聚丙烯酰胺凝胶1）概念：丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂NN甲叉双丙烯酰胺（BIS）按一定比例混合，在催化剂（如过硫酸铵）作用下聚合而成的交叉网状结构的凝胶，使其产生分子筛效应。2）催化系统：化学催化剂硫酸铵和四甲基乙二胺（TEMED） 光聚合催化剂核黄素3、SDS-凝胶电泳原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS（十二烷基硫酸钠），则蛋白质分子的迁移率主要取决于其相对分子量大小，而与她的形状大小及所带电荷无关。4、等电点聚焦电泳：测蛋白质PI； 以及 分子量的测定。5、电泳： 1) 基本电泳琼脂糖凝胶电泳；PAGE。 2) 等点聚焦电泳 3) 毛细管电泳 第六章 基因克隆技术1、分子杂交：（1）DNA 体外杂交（Southern杂交）（2）RNA杂交（Northern杂交）：（3）Western杂交（蛋白质杂交）：2、PCR技术： 1）概念：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩增出来的技术。 2）过程：变性-退火-延伸3）体系：引物（primer）酶 （Taq DNA polymerase） dNTP模板 （template） Mg2+ （magnesium） 4）引物设计的原则8个方面： 引物长度： 15-30bp，常用20bp左右引物扩增跨度：以500bp为宜 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 避免引物内部出现二级结构和引物间互补 引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）引物5端可修饰 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。3、重组DNA的鉴定技术： （1）探针的种类：基因组DNA探针、 cDNA探针、 RNA探针、 寡核苷酸探针。（2）Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1）变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性。 2）转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3）靶核酸为RNA（3）Southern印迹的主要步骤：DNA变性（碱变性）中和Southern印迹预杂交杂交洗膜检测探针：DNA或RNA 转膜：滤纸或电转移（4）Northern杂交过程：获得RNA电泳分离转移杂交（变性剂预处理杂交）结果 探针：DNA或RNA片段。 转膜：滤纸或电转移 （5）蛋白质印迹技术：1）步骤：蛋白质样品制备蛋白质凝胶电泳转膜（电转移）封闭一抗杂交二抗杂交底物显色2）探针：抗体 3）转膜：电转移 4）在医学的应用： a、酶切图谱分析 b、特定基因定性和定量 c、基因突变分析 d、限制性片段长度多态性的分析 （6）影响杂交的因素：a、核酸分子的浓度和长度；b、温度； c、离子强度；d、甲酰胺；e、核酸分子的复杂性；f、非特异性杂交反应。4、基因芯片：将大量的基因片段有序的，高效的排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称为基因芯片。5、DNA序列的测定：（1）Sanger双脱氧链终止法： 原理：在模板指导下，DNA聚合