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维生素C概述及其合成工艺应化072 李林艳 2007034210计算机网络维生素C (Vitamin C, VC)主要存在于生物组织中,在新鲜水果、蔬菜和动物肝脏中的含量尤为丰富。VC的化学名称为L ( + ) - 苏阿糖型- 2, 3, 4, 5, 6 - 五羟基- 2 - 己烯酸- 4 - 内酯,分子式为C6H8O6 ,分子量176. 13 VC中文别称L-抗坏血酸，维他命C，丙种维生素，英文名称：Vitamin C，L(+)-Ascorbic acid。 ,结构式，VC是一种人体必需的水溶性维生素,也是一种抗氧化剂,广泛应用于医药、食品、饲料、化妆品等诸多领域,具有广阔的市场前景。VC自1928年发现以来，是维生素类药物中发展最快、产量最大、用途最广的品种。随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的不断提高，对维生素C的需求量与日俱增。为了提高VC的质量和收率,国内外一直在对其生产工艺不断地进行改进。VC主要生理功能 （例如、）1、 促进骨胶原的生物合成。利于组织创伤口的更快愈合； 2、 促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命。 3、 改善铁、钙和叶酸的利用。 4、 改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病。 5、 促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血。； 6、 增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。 药物作用 维生素C在体内参与多种反应，如参与氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。从组织水平看，维生素C的主要作用是与细胞间质的合成有关。包括胶原，牙和骨的基质，以及毛细血管内皮细胞间的接合物。因此，当VC缺乏所引起的坏血病时，伴有胶原合成缺陷，表现为创伤难以愈合，牙齿形成障碍和毛细血管破损引起大量瘀血点，瘀血点融合形成瘀斑。 1胶原蛋白的合成需要维生素C参加，所以VC缺乏，胶原蛋白不能正常合成，导致细胞连接障碍。人体由细胞组成，细胞靠细胞间质把它们联系起来，细胞间质的关键成分是胶原蛋面发生，则产生淤血、紫癍；在体内发生则引起疼痛和关节涨痛。严重情况在胃、肠道、鼻、肾脏及骨膜白。胶原蛋白占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。如骨骼、血管、韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑，并且有助于人体创伤的愈合。 2坏血病。血管壁的强度和VC有很大关系。微血管是所有血管中最细小的，管壁可能只有一个细胞的厚度，其强度、弹性是由负责连接细胞具有胶泥作用的胶原蛋白所决定。当体内VC不足，微血管容易破裂，血液流到邻近组织。这种情况在皮肤表下面均可有出血现象，乃至死亡。 3牙龈萎缩、出血。健康的牙床紧紧包住每一颗牙齿。牙龈是软组织，当缺乏蛋白质、钙、VC时易产生牙龈萎缩、出血。 4预防动脉硬化。可促进胆固醇的排泄，防止胆固醇在动脉内壁沉积，甚至可以使沉积的粥样斑块溶解。 5.是一种水溶性的强有力的抗氧化剂。可以保护其它抗氧化剂，如维生素A、维生素E、不饱和脂肪酸，防止自由基对人体的伤害。 6治疗贫血。使难以吸收利用的三价铁还原成二价铁，促进肠道对铁的吸收，提高肝脏对铁的利用率，有助于治疗缺铁性贫血。 7防癌。丰富的胶原蛋白有助于防止癌细胞的扩散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害防止细胞的变异；阻断亚硝酸盐和仲胺形成强致癌物亚硝胺。曾有人对因癌症死亡病人解剖发现病人体内的VC含量几乎为零。 8保护细胞、解毒，保护肝脏。在人的生命活动中，保证细胞的完整性和代谢的正常进行至关重要。为此，谷胱甘肽和酶起着重要作用。 谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸组成的短肽，在体内有氧化还原作用。它有两种存在形式，即氧化型和还原型，还原型对保证细胞膜的完整性起重要作用。VC是一种强抗氧化剂，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，从而发挥抗氧化作用。 酶是生化反应的催化剂，有些酶需要有自由的琉基（-SH）才能保持活性。VC能够使双硫键（-S-S）还原为-SH，从而提高相关酶的活性，发挥抗氧化的作用。 从以上可知，只要VC充足，则VC、谷胱甘肽、-SH形成有力的抗氧化组合拳，清除自由基，阻止脂类过氧化及某些化学物质的毒害作用，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢。 9提高人体的免疫力。 白细胞含有丰富的VC，当机体感染时白细胞内的VC急剧减少。VC可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力。 促进淋巴母细胞的生成，提高机体对外来和恶变细胞的识别和杀灭。 参与免疫球蛋白的合成。 提高CI补体酯酶活性，增加补体CI的产生。 促进干扰素的产生，干扰病毒mRNA的转录，抑制病毒的增生。10提高机体的应急能力。人体受到异常的刺激，如剧痛、寒冷、缺氧、精神强刺激，会引发抵御异常刺激的紧张状态。该状态伴有一系列身体，包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增多。肾上腺髓质所分泌的肾上腺素和去甲肾上腺素是有酪氨酸转化而来，在次过程需要VC的参与。 进入人体的维生素C很快分布于个组织器官，在正常情况下，人体维生素C库为1500毫克。多余的大部分随尿排出，少部分随大便、汗及呼吸道排出。但是在感染情况下，人体所需的为平时的20-40倍之多，而且所有的药物都会破坏体内的VC。所以在人体有状态的情况下补充VC是非常有益的。维生素C是维持生物正常生长发育必需的一类微量营养物质，医学研究它对人体健康具有极其重要的药理作用，促进骨胶原的生物合成，利于组织创伤口的更快愈合；促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命；改善铁、钙和叶酸的利用；改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病；促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血；增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。其药理作用应用于治坏血病，抗癌，抗衰老，治疗不孕症，精神病肝胆疾病，防治体脉粥样硬化等方面。同时维生素C对人体也有副作用。维生素C的毒性很小，但服用过多仍可产生一些不良反应。常见的有1,胃肠道反应：长期大剂量口服维生素C可致恶心、呕吐、腹痛、腹泻、胃酸过多、胃液返流等，还可引起胃溃疡疼痛加剧甚至出血。为减轻以上反应，宜饭后吃药或减少剂量。2、泌尿系统的损害：服用大剂量维生素C可引发泌尿系结石。3、血液系统损害。4、影响生育能力:生育期妇女,若每天给予维生素C2g以上,可降低生育能力。5、假性糖尿: 6、过敏反应:个别病人应用维生素C后可出现过敏反应，如发热、皮疹、荨麻疹,严重者可致过敏性休克。7、其他反应:少数病人可出现面部潮红、头痛、失眠等。8、长期大剂量使用维生素C时,可致低钠血钠症、高钙血症、高尿酸血症以及痛风性关节炎发作等。动脉硬化病人应用大剂量维生素C,可使血清胆固醇升高，偶可引起突然死亡。大剂量应用维生素C，还可引起对高海拔缺氧抵抗力显著丧失。对呼吸系统疾病、感冒及其它传染病人,每日剂量不宜超过2g。 9、大剂量高浓度静注维生素C时可引起静脉炎。10、致畸作用:孕妇长期大剂量(每日2g以上)服用，可影响胎儿发育,且胎儿出生后易引起坏血病。 11、干扰大便隐血试验:维生素C每日口服大于2g时，可掩盖大便隐血试验,造成假阴性反应。12、乳儿服用大剂量维生紊C,往往会出现乏力、徐脉（脉搏慢）、血小板增多、肠蠕动亢进、消化不良、不安、皮疹、浮肿等。生长期儿童服用大剂量维生素C，可使儿童日后易患骨病。故乳儿宜慎用。13、近期美国研究发现，维生素C能作为催化剂帮助生成一种“基因毒素”，而这种毒素与DNA即遗传物质脱氧核糖核酸作用后，将会导致DNA发生突变(致癌等)。维生素C能驱除细胞内的有害自由基，而这些有害自由基是高度活跃分子，除了能直接损伤DNA外，还能通过转化亚油酸间接地发挥作用。而亚油酸则是存在与葵花子、葡萄、红花、食用油以及人体血浆中主要的多不饱和脂肪酸。自由基首先将亚油酸转化为另外一种叫脂类氢过氧化物的物质，然后当某种金属离子存在并充当催化剂时，脂类氢过氧化物就会进一步降解成为能破坏DNA的“基因毒素”。在试管实验中，还发现维生素C能够在没有金属离子存在的情况下替代其作用，而诱发脂类氢过氧化物产生“基因毒素”。所以维生素C在保护DNA的同时也具有伤害DNA的能力。制备维生素C常见的方法有以下几种：一莱氏法莱氏法是1933年德国化学家Reichstein等发明的最早应用于工业生产VC的方法。该法以葡萄糖为原料,经催化加氢制取D - 山梨醇,然后用醋酸菌发酵生成L - 山梨糖,再经酮化和化学氧化,水解后得到2 - 酮基- L - 古洛糖酸(2 - KLG) ,再经盐酸酸化得到VC。莱氏法生产的VC产品质量好、收率高。由于生产原料廉价易得,中间产物的化学性质稳定,但是莱氏法也存在不少缺陷,诸如生产工序多、劳动强度较大,使用大量有毒、易燃化学药品,容易造成环境污染等。二二步发酵法。该法以生物氧化过程代替莱氏路线中的部分纯化过程,简化了生产工艺,降低了生产成本,减少了“三废”污染,多年以来一直被国内厂家使用。二步发酵法生产VC可以分为发酵、提取和转化三大步骤,即D - 山梨醇先经细菌氧化为L - 山梨糖,再通过细菌发酵生成VC前体2 -KLG,最后用化学法将2 - KLG转化为VC。2. 1发酵工艺二步发酵法的生物转化过程如下: D - 山梨醇黑醋酸菌L - 山梨糖 大菌、小菌 混合发酵 2 - KLG其中,D - 山梨醇转化为L - 山梨糖是由黑醋酸菌完成的,该工艺在莱氏法中就已使用,由于工艺成熟且生物转化率高(98%以上) ,因此在二步发酵法中得以延用。近年来,国内外对这项工艺的研究甚少,研究方向主要集中在二步发酵法的第二步,即由L - 山梨糖转化为2 - KLG。该步为混菌发酵,目前其代谢机制尚不清楚,也未得到相关基因。自二步发酵法发明推广以来,国内外对该步的研究除了优化发酵工艺外,主要集中在大、小菌的关系和优良菌株的选育方面。VC工业生产常用的小菌为氧化葡萄糖酸杆菌,大菌为巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或条纹假单孢杆菌。焦迎晖等通过分析VC二步发酵过程中活菌数、产酸量、pH值和糖酸转化活力等,进一步证实了小菌具有将L - 山梨糖转化为2 - KLG的能力,而大菌本身不产酸,其作用仅仅是通过刺激小菌的生长而促进小菌产酸。冯树等研究发现大菌的胞外液还具有促进小菌转化L - 山梨糖生成2 - KLG的作用,具有该作用的组分的分子量包括30 - 50 kD和大于100kD两部分,其中前者是一种含铁和锌的蛋白质。刘祯等发现一株葡萄糖酸杆菌正向突变株,该菌株前期生长及产酸明显高于生产菌株201C,经流加发酵工艺培养,可缩短发酵周期8 h,山梨糖生成2 - KLG的摩尔转化率达80%。陈建华等用配对法筛选得到氧化葡萄糖酸杆菌10 - 3的优良伴生菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 97002,混合菌发酵生产2 - KLG,山梨糖的转化率达90%。2. 2提取工艺二步发酵法两次发酵以后,发酵液中仅含8 %左右的2 - KLG,而残留菌丝体、蛋白质、多糖或悬浮微粒等杂质的含量却很高。这给2 - KLG的分离提纯带来了很大困难,致使后处理费用占总成本的比例较大。目前, VC工业生产中常用的2 - KLG的分离提纯方法有加热沉淀法、化学凝聚法和超滤法。2. 2. 1加热沉淀法加热沉淀法是2 - KLG分离提纯的传统工艺,分离手段较为落后。此工艺通用氢型树脂,调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失,且发酵液直接通过树脂柱,造成树脂表面污染,降低树脂的交换容量和收率。两次通过树脂柱带进了大量水分,也增大了浓缩耗能。2. 2. 2化学凝聚法化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质,避免了加热沉淀时有效成分的损失。季光辉等采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理,使2 -KLG的滤液质量提高,提取前步收率提高5. 2% , VC总收率提高2. 5%以上。陈雷等以壳聚糖为主凝剂,聚丙烯酰胺为助凝剂,通过化学凝聚法除蛋白工艺,提取收率由原来的76%提高到82% ,古龙酸优级品率由原来的35%提高到60% ,成本比原来降低20%。但是,化学凝聚法也存在不足,主要表现在处理后的发酵液离心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白,如发酵液染菌则处理的效果更不明显,上清液浑浊,严重影响产品的质量和收率。此外,所用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。2. 2. 3超滤法超滤是一种新兴的膜处理技术,此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点,因此在2 - KLG的分离提纯中的应用日益广泛。此法与加热沉淀法不同的是,可在常温下操作,可减少有效成分的损失; 在用膜除蛋白的过程中,无任何新的化学物质加入,可减少对树脂的污染和损耗,降低酸碱用量,减少三废排放。与化学凝聚法不同的是,在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的处理效果。2. 3转化工艺无论是莱氏法还是二步发酵法制得的2 - KLG,目前在生产上都是通过化学反应过程转化为VC。根据所选试剂的不同,二步发酵法可分为酸转化法和碱转化法。2. 3. 1酸转化法VC化学转化生产,自莱氏法建立以来就采用浓盐酸催化2 - KLG ,一步制得VC。在以饱和氯代烃(如CHCl3 ) 、芳烃(如苯、甲苯)为溶剂,由2 - KLG与浓盐酸在6075 下反应46 h ,可制得纯度为90 %的粗VC。2 - KLG 与浓盐酸在表面活性剂Me(CH2 ) 5N +Me3Cl的甲苯溶液中反应,可制得纯度超过99%的VC。2. 3. 2碱转化法我国VC生产厂家均采用碱法转化2 - KLG生产VC。东北制药总厂等生产单位将2 - KLG与甲醇在浓硫酸催化下生成2 - 酮基- L - 古龙酸甲酯,该酯在NaHCO3 作用下发生内酯化反应生成VC钠盐。该法避免了酸催化的上述缺点,且操作工艺简单,反应条件温和,适合于规模化生产,但是在生产中的反应周期过长,甲醇单耗高。有些单位尝试用CH3ONa代NaHCO3 进行碱转化,转化率可高达92. 6 % ,但产品质量较差,且甲醇钠价格贵,造成生产成本较高。国外学者对碱转化的研究也一直在进行。Bottcher等用丁醇代替甲醇,采用浓硫酸催化,在真空度0. 02MPa 、85 的条件下与2 - KLG进行反应, 2 h后蒸去多余的丁醇及生成的水,向反应体系中加入氯乙烯和盐酸,在7275 加热17 h,过滤后得到纯度为98 %的VC。Veits用离子交换树脂作催化剂,使2 - KLG与甲醇的反应液于80 下在树脂柱中停留10120 min,然后将酯化液与NaHCO3 作用得到纯度为98 %的粗VC钠盐。美国Fastman化学公司的研究人员将模拟流动床( SMB)反应器应用于该酯化反应,通过SMB反应器脱水以促进酯化反应的进行。Oklobdzu等通过二步酯化过程促进酯化反应的进行,有效地实现了分离反应产物和反应过程中生成的水。由VC钠盐制备VC所采取的主要方法是硫酸酸化法和树脂交换法。硫酸酸化法操作简单,但需妥善控制甲醇的浓度和pH值,才能使硫酸钠与VC得以分离。氢型离子树脂交换法设备庞大,操作复杂,且需经常再生树脂,增加了酸耗,酸液大量排放容易对环境造成威胁。目前,人们正在积极探索使用双极性膜(BipolarMembrane Electrodial2ysis,BME)来代替传统的酸化工艺,其工作原理为:在直流电场作用下, 双极性膜中的水被离解成H+和OH- ,H +替换VC钠盐中的Na +结合成离解度小的VC,原VC钠盐中的Na +在电场的作用下通过阳离子交换膜从VC钠盐中分离出来, 并和OH- 结合生成NaOH。双极性膜电渗析法无需外加物料可将VC钠盐转化成VC,过程简单,能耗低,投资少,转化率高,其副产品和NaOH稀溶液也可被有效利用,对环境无污染,有望应用到实际生产中。三，维生素C的生物合成维生素C的生物合成途径目前仍不完全清楚。目前研究表明，wheeler等唧提出的半乳糖途径在植物维生素C的生物合成中占主导地位，但不能排除其它途径的可能，尤其是已经报道的糖醛酸衍生物可转化为维生素C的现象。对拟南芥悬浮细胞的研究发现植物体可以由葡萄醛酸甲酯和半乳糖醛酸甲酯合成维生素C121。最近从草莓果实中克隆D一半乳糖醛酸还原酶基因在拟南芥中表达可以使其维生素C含量提高23倍。这为糖醛酸作为维生素C合成底物提供了分子依据。把编码L一古洛糖醛酸一1。4一内酯氧化酶基因转化到烟草和莴苣中可以使它们维生素C含量提高47倍目前仍不清楚该酶是否可以对已知植物维生素C合成的底物L一半乳糖醛酸一14一内酯起作用或者植物体本身可以产生L一古洛糖酸一l，4一内酯j有人提出可能存在1个可以催化L一半乳糖醛酸一1，4一内酯和L一古洛糖酸一l，4一内酯相互转化的3一C表异构酶 。Wagnera等在研究维生素C代谢模式中发现在拟南芥中存在古洛糖酸，他们提出植物可能存在一个类似于动物的维生素C合成途径。最近，Argelia等的研究认为肌醇也能通过肌醇加氧酶的作用进入糖醛酸途径从而在植物体合成维生素C。迄今为止已经有4种可能的植物维生素C合成途径被提出即：半乳糖途径、糖醛酸途径、古洛糖途径和肌醇途径。 2合成路线中几个重要问题的探讨21菌种选育在维生素C生产路线研究中，高产菌株的筛选是实现工业化的关键，优良的菌种对于维素C产量和经济效益的提高具有特殊重要意义。二步发酵法的第二步发酵是采用大菌、小菌2株菌的混合发酵过程，2株菌缺一不可。维生素C工业生产中常采用的小菌为氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)，大菌为巨大芽孢杆菌(BaciUusmegaterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereu)或条纹假单孢杆菌(Pseudemonasstritia)。研究发现，在大、小菌的混合培养中，两者的增殖是同步进行的。小菌是2-KLG合成的主体，大菌一方面直接参与2-KLG的合成过程，一方面对小菌的生长起促进作用。小菌合成的2-KLG对大菌的生长增殖有明显的抑制作用，而大菌的存在却是小菌的生长增殖和合成2-KLG所必需的。深入研究发现，大菌的胞内液和胞外液均可促进小菌的生长，大菌胞外液中具有该作用的组分的分子量在100kD以上。此外，胞外液还具有促进小菌转化I山梨糖生成2KLG的作用，具有该作用的组分包括3050kD和大于100kD两部分，其中前者系一种含铁和锌的蛋白质。二步发酵法第二步发酵过程的菌种选育一直是微生物发酵法生产维生素c研究的热点课题之一。为了克服传统二步发酵法的缺点，人们开始尝试构建优良的产2-KLG工程菌。工程茵的构建主要建立在人们对二步发酵法菌种相关关键酶的研究基础之上。遗憾的是，这些研究均处于实验室研究或小试阶段。近年来，国内外学者开展了以葡萄糖作为直接发酵原料的研究。其中，美国AndersonS等人在证实了到棒状杆菌中2，5一二酮基一D葡萄糖酸(简称2，5-DKG)的生物还原作用后，首先纯化和鉴定了其中的还原酶，并测定了N-末端的40个氨基酸顺序，制备了合适的多核苷酸探针，分离得到2，5。二酮基-D一葡萄糖酸还原酶基因，再继续进行基因克隆和表达载体构建，将此载体转移到一株草生欧文氏杆菌中表达，从而实现了从D葡萄糖经过一步直接转化就可生产2酮基L-古龙酸。这只是简单的基因克隆和载体的表达，实际上在细胞内的情况要复杂得多。应用重组DNA技术构建“代谢工程菌”的成功，为今后维生素C生产菌的选育和深入研究开辟了新途径。22酯化工艺维生素C合成中，从古龙酸到抗坏血酸钠的转化，经过一个可逆的酯化醇解反应【14】：文献报道，醇解反应速度较快，一般2h即可充分反应。东北制药总厂王凤英等人用薄层层析方法跟踪醇解反应进程，确定反应终点。结果证明，碱转化3h就可以反应完全，并且缩短酯化时间对提高质量和收率都有好处。由于抗坏血酸钠在醇中的溶解度随着温度的变化不大，所以在常温下出料、过滤、洗涤后损失不大，母液和洗液中残留量无大变化。实验中，带水醇的蒸发是关键。酯化平衡是限制收率的因素，虽然经过9h的煮沸能够达到很高的酯化度，但抗坏血酸钠在长时间的煮沸中难免受到破坏，形成杂质。只要能够保证带水醇蒸发的速度，单位时间里蒸发出的甲醇达到一定的量，酯化反应可以到底，减少甲酯的被破坏，这样就能在保证收率的情况下提高质量。这就是缩短反应时间后，质量和收率都提高的原因。过去，维生素C的化学转化均采用加酸转化的方法，现在，国内已有约13以上的制药厂采用了这种加碱转化工艺，大大提高了产品的纯度和精制收率，并且节水、节气、节电，取得了较好的效益。然而，就我国现有生产条件而言，必须加强对甲醇的安全防护措施和降低设备材质的消耗。23酸化工艺发酵法生产维生素C过程中，发酵液中的古龙酸钠转化为古龙酸及VCNa转化为维生素C是两个主要步骤。目前，前者采用离子交换法，后者采用硫酸酸化沉淀法。离子交换法需经常用酸再生，设备庞大，消耗大。硫酸酸化则过程复杂，消耗高。此外，上述两种方法均有大量废液排放。双极性膜电渗析法(简称BME法)可以在无需#l-力n物料的条件下，将古龙酸钠转化成古龙酸，将VCNa转化成维生素C。用BME法使VCNa转化成维生素C的技术是利用在直流电场作用下，双极性膜中的水被离解成H+和oH-。矿与VCNa中的维生素C酸根结合成离解度小的维生素C，VCNa中的Na+在电场作用下通过阳离子交换膜从VCNa中分离出来，并和双极性膜阴膜侧出来的OH-结合生成NaOH。发酵法生产中VCNa酸化的原流程是将VCNa甲醇溶液加硫酸酸化，制得粗维生素C干品，再经水溶解以后用活性炭脱色、重结晶制得成品维生素C。上述酸化过程可以用BME技术代替，其过程如下：溶液中VCNa的转化率可达99以上，总收率达875，制得的维生素C粗品中维生素C含量95，钠盐含量O4，达到生产要求。这种方法过程简单，能耗低，设备体积小，投资少，操作方便，转化率高，无环境污染。若将此工艺在工业上推广应用可以提高经济效益，减少环境污染。 四，酵母合成维C l 酵母合成VC酵母菌在工业生产上应用十分广泛，人们对其特性非常了解，具有工业大规模生产的优势JJ。首先，其营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；其次其具有强烈的好氧性，可进行细胞高密度培养，在发酵罐中细胞干重能达到20 gL。因此，利用酵母发酵生产VC是一个很好的策略。虽然在酵母提取物中已发现Vc的存在-4。，但是，在自然条件下，酵母菌并不能合成VC，它只能合成一种VC类似物D红抗坏血酸(Derythroaseorbie acidDEAA)。DEAA和VC一样具有还原性，但不具备VC的生物活性。有趣的是，人们在通过比较植物合成VC途径和酵母菌合成DEAA途径后发现，这两条途径最后两步反应中分子结构的变化惊人的相似：在酵母菌中D阿拉伯糖转化成D阿拉伯糖1，4一内酯(Darabinono一1，41aetone)，进而生产DEAA；在植物中L半乳糖经L半乳糖1，4一内酯(Lgalactono一1，41aclone)再生成VC。因此，人们思考利用DEAA途径的酶来合成VC。 Oba等从番薯中分离纯化出了L-半乳糖1，4内酯脱氢酶(L-galactono141actonedehydrogenase)，其相对分子质量(肘，)为56 000，对底物L-半乳糖1，4内酯反应的Km为012mmolL，需要细胞色素c为电子受体。Wheeler等_6 J从豌豆和拟南芥(Athaliana)中鉴定出L-半乳糖脱氢酶，该酶以NAD为辅基。Huh等在白色念珠菌(Candida albicans)TCC 10231分离得到了D阿拉伯糖一1，4内酯脱氢酶(Darainono-1，4-laetone oxidase)，该酶的肘，为66 700，对底物D阿拉伯糖1，4内酯的Km为44I mmolL，其催化底物较广，能催化L一阿拉伯糖一1，4内酯、三半乳糖一1，4-内酯和古龙1，4内酯(L-删ono-I，4-laetone)反应。而后，他们又在酿母(Saccharomyces cerevisiae)找到了D一阿拉伯糖1，4内酯脱氢酶。Kim等对D阿拉伯糖脱氢酶也做了研究。D阿拉伯糖脱氢酶催化的范围也比较广，能催化D一阿拉伯糖、L一海藻糖、L-木糖和L一半乳糖，对在c2和C3位置具有羟基的糖都能催化。植物合成VC和酵母合成DEAA最后两步中酶的结构不同，有不同的辅基和电子受体。不过，在体外的催化实验证明，DEAA途径中最后两步的酶能催化L-半乳糖和L阿拉伯糖1，4内酯。Hancock等在酿酒酵母中加入了L-半乳糖成功地收集到了VC，分析是菌体中D阿拉伯糖脱氢酶和D阿拉伯糖1，4内酯脱氢酶催化反应的进行。由此可见，酵母在L-半乳糖存在的条件下，能利用本身DEAA途径来生成VC。Sauer等利用酿酒酵母(Scerevislae)和拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)进行了实验。在培养基(2葡萄糖，067YNB)中培养72 h，在不加底物L-半乳糖或L-古龙酸1，4一内酯的条件下Scerevisiae和Zygosaccharomyces bai如i不能够生成VC；在培养24 h后补加250 mgL的L一半乳糖，继续培养24 h就能检测到VC合成，但不分泌到胞外。为了增强Scerevisiae转化工一半乳糖能力，他们把ScerevisiaeALOI基(D一阿拉伯糖1。4内酯氧化酶)和Athaliana AGD基因(编码L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶)插入酵母的穿梭质粒中，然后加上强启动子Scerevisiae TPl。转化到Scerevisiae中，发现酵母不仅能在胞内积累VC，而且还能分泌到胞外。这一惊奇的发现促使他们继续研究，将Scerevisiae AL01基因和Athaliana LGDH基因转入Scerevisiae中，结果发现，发酵6 d后，发酵液中VC达70 msL，酵母菌中仍含有vc 30 mgLL一半乳糖的转化率达40。酵母在有L半乳糖及衍生物存在的条件下，能够自身合成VC，并能分泌到胞外，为工业生产VC开辟了一条新的道路。不过，酵母合成VC还存在一个难题。由于己一半乳糖及衍生物价格高，用其作为底物发酵生产VC因成本高，在工业上不可行。Branduardi等利用基因工程技术向Scerevshre中引入了3种关键酶，这3种酶能催化GDP-D。甘露糖转化成L_半乳糖，这样就实现了利用酵母菌直接从D一葡萄糖生成VC。最后，他们成功得到了2株不同的菌株。通过发酵条件的优化，在活性氧(Reactive oxygen species，ROS)低水平表达的情况下，酵母中有大量的VC积累，解决了底物问题。从此，利用酵母菌从D葡萄糖生成VC的工业化生产将成为现实。2微藻合成VC微藻是人们研究合成VC的另一种真核微生物。与酵母菌不同的是，微藻中天然存在VC的合成途径，能够自身合成VC。Berry等。14 J提出了Pmonforms合成vC的途径。D葡萄糖代谢经过GDPD一甘露糖，GDP-L一半乳糖，L-半乳糖和半乳糖1，4一内酯，L一半乳糖1，4一内酯在L-半乳糖1，4脱氢酶的作用下脱氢生成VC。另外，微藻来源广，价格也非常便宜，因此利用它来工业化合成VC是有可能的。Running等尝试用异养绿微藻Chlorella pyrenoidosa一步发酵合成Vc，得到了40 mgL的VC，产率非常低。后来，他们利用化学诱变剂对该微藻进行诱变育种，并对发酵条件进行了优化，使VC的产率提高到了2/L，比原始菌株C1ryrenoidosa UTEX 1663提高了70倍。不过，合成的VC主要集中在微藻细胞中，不利于VC的收集和大规模生产；但如果直接把微藻作为高营养的饲料和食品添加剂，则此方法就有很好的应用价值。Running等选取9株Prototheca monformis和43株Prothec speciesa进行vc合成研究，在它们的培养液中均有VC存在。通过培养条件的优化后，VC在发酵液中的含量可以高达76 mgL。利用诱变育种技术，得到1株Prototheca mori加m厶ATCC 75669，不仅使VC合成量比原始菌有很大的提高，并且能分泌到胞外，证实了利用微藻工业化生产VC的可