逆转录PCR讲义.doc

逆转录巢式PCR（nested RT-PCR）一、实验目的：学习RT-PCR反应的基本原理。掌握血液等液体标本中提取RNA并逆转录的技术。了解其他标本（如组织块）中提取RNA的技术。二、实验原理RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经逆转录酶的作用以RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。巢式PCR是一种特殊的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物（外引物）扩增片段与普通PCR相似；第二对引物（内引物）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次继续在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR特异性非常高。三、主要仪器PCR扩增仪、高速冷冻离心机/台式高速离心机、Vortex震荡混匀器、水平电泳仪、凝胶成像系统、电热恒温水浴锅四、主要试剂TRIzol ReagentTM、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶（MgCl2）、dNTP Mixture，10 mmol/L、琼脂糖、溴化乙锭*、DNA Marker、三氯甲烷（氯仿）、异丙醇DEPC*（焦碳酸乙二酯）处理水：加100l DEPC于100ml超纯水中，使DEPC的体积分数为0.1%，室温震荡至少4h；然后高压蒸汽灭菌20min。溶解RNA所需的DEPC水用无RNase的1.5ml 微量离心管分装，-20保存；用于配置75%乙醇的DEPC水则直接置于4保存。75%乙醇溶液：取75ml无水乙醇用DEPC处理水定容至100ml，4保存。所用容器及量筒均需洗净后200干烘8h。5TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA（pH8.0）20ml，加蒸馏水定容至1L，室温保存。0.5TBE缓冲液：用蒸馏水将50TBE缓冲液稀释10倍，于室温下保存。五、操作步骤病毒RNA的提取：1. 将待测标本、阴阳性对照取出解冻；再取出2套RNase-free（无RNase）的1.5ml微量离心管和2支RNase-free的0.5ml微量离心管，并进行标记；2. 取一套标记好的离心管，每管加入TRIzol 500l，再加入100l血清/细胞培养液等液体标本和对照（阴性对照最先加，标本居中，阳性对照最后加；注意将枪尖伸至TRIzol中），用Vortex震荡混匀5sec（液体无明显分层），室温静置5min；3. 每管加入氯仿100l（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），用Vortex震荡混匀15sec（液体无明显分层），室温静置3min；4. 4、12000rpm离心15min；待离心结束后，小心吸取上层水相至另一套标记好的RNase-free的1.5ml 微量离心管，加入等体积异丙醇（根据吸取的量估算，可适当多加一些；注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），颠倒混匀，室温静置15-30min；同时，确认恒温水浴锅已打开；5. 4、12000rpm离心10min；待离心结束后，直接倒去上清，每管加入75%乙醇500l重悬沉淀（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），轻柔颠倒混匀5次；与此同时，取出特异性引物/寡核苷酸引物/随机引物、RNasin、5RT Buffer、dNTP Mixture解冻；6. 4、8000rpm离心5min；待离心结束后，小心倒去上清；用瞬时离心机简短离心1-2s，仔细观察沉淀位置，沿管壁吸出底部残余液体；室温晾干5-10min（应防止过分干燥）；7. 最后加入20l DEPC处理水溶解RNA沉淀，直接用于后续实验，或保存于-80备用。逆转录（RT）：在0.5ml RNase-free（无RNase）的微量离心管中依次加入：DEPC处理水9.0l外循环下游引物（20pmol/l）0.6lRNA酶抑制剂（40U/l）0.1l总体积9.7l再加入RNA溶液5l，70水浴5min，再冰浴5min；再依次加入：5AMV逆转录反应缓冲液4.0ldNTP Mixture（10mol/L）1.0lRNA酶抑制剂（40U/l）0.1lAMV逆转录酶（5U/l）0.2l总体积5.3l42温育40min。巢式PCR（nested PCR）：第一轮PCR扩增体系为：10PCR反应缓冲液2.0lMgCl2（25mol/L）1.2ldNTP Mixture（10mol/L）0.2l上游引物（20 pmol/l）0.2l下游引物（20 pmol/l）0.2lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.2lcDNA2.0ldd H2O补足反应体积至20l第二轮PCR扩增体系为：10PCR反应缓冲液2.0lMgCl2（25mol/L）1.2ldNTP Mixture（10mol/L）0.2l上游引物（20 pmol/l）0.2l下游引物（20 pmol/l）0.2lTaq DNA聚合酶（5U/l）0.2l第一轮PCR产物2.0ldd H2O补足反应体积至20lPCR仪扩增条件为：94 预变性 5min94 变性 30s53 复性 30s 35个循环72 延伸 40s 72 再延伸 5minPCR产物的检测（琼脂糖凝胶电泳）：1. 琼脂糖凝胶板的制备：称取2.0g琼脂糖，加入100ml 0.5TBE，于微波炉中加热融化均匀，冷却到60-70加EB至终浓度0.5g/ml，倒入封好的凝胶槽，厚度约3-5mm，在距底板0.5-1mm的位置放置样品梳，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳槽中，缓冲液没过胶面1-2mm即可；2. 加样：样品中加入1/5体积的6凝胶上样缓冲液，混匀，取5-6l加入凝胶点样孔中，同时加入DNA Marker；3. 电泳：100V恒压，电泳30min，使PCR产物向阳极移动。待溴酚蓝移至凝胶的2/3距离时，关闭电源；4. 取出凝胶，置于紫外交联透射仪上检测扩增条带并在凝胶成像系统下拍照。首先，你要确认切胶后是否回收到了RTPCR的产物（方法、操作不当会导致回