蛋白质化学总结.docx

蛋白质化学1、简述氨基酸的结构特点及两性解离特性。答：特点：氨基酸是蛋白质分子的基本组成单位。在20种基本氨基酸中，除脯氨酸-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余L-氨基酸；每种氨基酸分子至少有一个氨基和一个羧基；至少有一个氨基和一个羧基链接在同一个碳原子上；各种氨基酸之间的区别在于R基团不同。两性解离特性：氨基酸分子在生理pH条件下形成了兼性分子（分子中含有等量的正电荷和负电荷，使该分子的净电荷为零）。氨基酸分子中除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在不同的pH溶液中可解离成正离子或负离子，因此氨基酸分子即可带有正电荷又可带有负电荷，这种性质称为氨基酸的两性解离。2、蛋白质一级结构测定的原理和结果分析。答：准备：样品必须纯（97 %以上）；确定蛋白质中所含的多肽链(亚基)的数目；二硫键的断裂；对每种亚基进行分离和纯化；确定亚基中氨基酸的组成。确定蛋白质分子中多肽链的数目，利用具有特异识别位点的蛋白酶将每条多肽链酶解成可以直接进行序列测定的短肽片段(包括断开多肽链内的二硫键)；分离并纯化各短肽片段；确定每条片段中的氨基酸顺序；利用不同识别位点的蛋白酶将多肽链酶解成不同的短肽片段，重复步骤-若干次；通过比较用不同的蛋白酶切割形成的短肽片段的序列，确定每条多肽链中氨基酸的顺序N-端测序1) Sanger法/DNFB法/二硝基氟苯法2,4-二硝基氟苯（Sanger试剂）在碱性条件下，与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用层析法进行鉴定。2) 丹磺酰氯（DNS）法在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基发生酰基化作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有强烈的荧光基团，检测灵敏度比DNFB法高100倍。3) Edman化学降解法/苯异硫氰酸酯/PITC法首先在pH9.0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(PhN=C=S，PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物；随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。从蛋白质或多肽氨基末端进行分析，不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。4) 氨肽酶法氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的N-末端残基。C-端测序5) 羧肽酶法羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个水解。依不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而推断蛋白质的C-末端残基。6) 肼解法多肽与肼在无水条件下加热，从多肽链上解离出C-端氨基酸，剩余部分变为肼化物，与C-端氨基酸分离。确定多肽链内及多肽链间的二硫键的位置。（二硫键可以被过甲酸氧化或被硫醇还原而断裂。过甲酸氧化可以断裂所有二硫键，但同时氧化Met残基，并破坏Trp侧链的吲哚基团。硫醇（2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤苏糖醇）还原性裂解二硫键。）（在测定多肽链的氨基酸序列之前，了解肽链中的氨基酸组成即每种氨基酸残基存在的数量是十分必要的。）将肽链完全水解以释放出所有的氨基酸，然后再对释放出来的氨基酸进行定量分析。酸催化水解法、碱催化水解法、酶催化水解法、3、对角线电泳法的原理及其应用。原理如果两次电泳间的特殊处理对蛋白质无影响，则电泳图谱中的蛋白点都在对角线上；如果该特殊处理对其有影响，则电泳图谱中的蛋白点偏离对角线。根据特殊处理的性质，可获得变化蛋白点的相关重要信息。目前其主要作用是膜蛋白的分离鉴定，及确定二硫键和蛋白质复合物的研究。应用水解后的肽混合物进行第一相电泳，样品点在中间，电泳毕，将样品纸条剪下，置于装有过甲酸的器皿中，用过甲酸蒸气处理2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，电泳条件与第一相相同，只是与第一次向成直角。在第二相电泳中，那些不含 -S-S-的电泳情况与第一相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那些含-S-S-的肽由于被氧化，电荷发生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对角线，肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快，操作简便以及能用于小分子样品，是直接分离 -S-S-肽的好方法。含 -S-S-肽被分离后，即可进行肽段顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的 -S-S-位置。4、多肽固相合成的原理及其优点。答：原理氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体，首先将一个氨基被封闭基团保护氨基酸的共价连接在固相载体上，在三氟乙酸的作用下，脱掉氨基的保护基，这样第个氨基酸连接到固相载体上了。然后第二个氨基被封闭的氨基酸的羧基通过N,N-二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基被DCC活化的第二个氨基酸再与已接在固相载体的、第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要肽链长度。最后脱去保护基，用HF水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的多肽。优点最初的反应物和产物都连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物，可以获得高产率产物，同时易于将产物分离。5、在蛋白质定性、定量分析中常用的氨基酸的理化性质有哪些，如何应用。答：物理性质：吸光度差异a. 近紫外吸收(280 nm)溶液中蛋白质的含量可以利用分光光度计进行测定。蛋白质在近紫外区的吸收主要依赖蛋白质中Tyr和Trp的含量(很少的因素来自Phe和二硫键)。因此在不同的蛋白质中，A280值会有很大的差异。b. 远紫外吸收肽键在约190nm的远紫外区具有很强的光吸收；由于氧气在该波长段的干扰以及传统分光光度计在该波长的灵敏度低，所以测量通常选择205nm，蛋白质在205 nm处的吸收将是在190nm处的一半；含有不同侧链的氨基酸，包括Trp，Phe，Tyr，His，Cys，Met，Arg的侧链(递减的顺序)对于A205均有贡献。化学性质c. Lowry法Lowry法是以双缩脲反应为基础的一种方法。蛋白质的肽键可以在碱性条件下与铜作用形成络合物，然后与Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)发生反应，具体的反应机理还不清楚，大体上是由于铜催化的芳香族氨基酸的氧化作用能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，反应最终生成具有蓝色的物质，颜色的强度与蛋白质中Trp、Tyr的含量有关d. BCA法(The Bicinchoninic Acid Assay)与Lowry法非常类似，原理上也是依赖于在碱性条件下Cu2+转变为Cu+的反应。然后利用Cu+与BCA反应形成紫色的络合物，测定其在562 nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。e.考马斯亮蓝G-250比色法由于G250所含的疏水基团与蛋白质的疏水微区具有亲和力，通过疏水作用与蛋白质相结合。当它与蛋白质结合后形成蓝色的蛋白质-染料复合物，其最大吸收波长变为595 nm。这种结合在2分钟左右达到平衡，生成的复合物在1小时内保持稳定。f. 利用微波快速蛋白质定量法利用微波的射线可以使得蛋白质检测实验中的温育从标准的1560 min缩短至几十秒。这种方法是建立在Lowry法和BCA法标准蛋白分析法的基础上的：当微波穿过样品时，样品内的分子就暴露在连续变化的电磁场中，被电离极化的分子将沿着电磁场的方向进行排列并随着场强的变化而快速旋转。场强越高则分子旋转的速度越快。而微波频率和可极化的分子大小存在着一定的关系。在常规微波炉所使用的2.45 GHz下，只有小分子才会旋转，尤其是水分子，但是蛋白质不能旋转。在微波炉中，样品中水分子旋转能的一部分会以热能的形式释放。由于样品中这些小分子能够高速旋转，所以微波炉能够提供非常有效的加热，并且一般的微波产生的热效应能引起局部温度的变化。同时还发现微波同时能够引起蛋白质分析时反应产物形成的速率，这种加速与温度的变化无关。6、测定蛋白质的分子量的方法有哪些？各自的原理是什么？请通过比较说明各种方法的优缺点。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子，在电场下向与自身电荷相反的方向移动。还原剂的解聚作用在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂-巯基乙醇(-mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol，DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键打开，形成长短不一的单链亚基。SDS的包裹作用SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时蛋白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDS复合物(protein-SDS micelles)。由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质-SDS复合物就会向正极移动，移动的速度与蛋白质本身带是什么样的电荷和带多少电荷无关，只与椭圆棒状的长短有关，也就是与亚基的分子量的大小有关，利用这一性质可以测定蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白质-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大，电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分开。未知蛋白分子量计算：相对迁移率mR=蛋白条带迁移距离(cm)染料迁移距离(cm)将未知蛋白的mR值查到log(M)值，便可知其分子量。计算分子量方法除了用标准曲线法外，还可以用比较法和机读法。（比较法:用标准蛋白的相对位置与未知蛋白的位置进行比较，初步判断。这是在发表论文时常用的表示方法。机读法：用凝胶扫描仪，将凝胶图谱扫描输入计算机中，通过影像文件系统处理，便很快得知未知样品的分子量。但发表论文时，仍然要注出原始图谱，因为经计算机处理的图谱有作假之嫌。）优点：操作方便、分辨率高、样品用量少、重复性好。缺点：对电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白(如糖蛋白)及一些结构蛋白等测出的相对分子质量不太可靠。凝胶过滤层析凝胶过滤层析(Gelfiltration)，也称为分子筛层析、凝胶排阻层析(Exclusion chromatography)。凝胶过滤层析介质是以不同浓度的凝胶交联聚合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶过滤层析介质对蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶过滤层析分离的过程中，大分子先流出，小分子后流出。标准曲线法分子量的测定一般都采用标准曲线法。使用几种不同分子量的混合标准蛋白，经排阻色谱进行分离会得到不同保留值的色谱峰，以分子量的对数值(lgMr)为纵坐标，以收集体积(ml)为横坐标，绘制标准曲线图。然后将未知样的标留体积在标准曲线上查得分子量。未知蛋白分子量计算：将未知蛋白排阻层析的洗脱体积从标准曲线上查到相应的log(M)值，便可求出其分子量。优点：不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行。不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处，对于高分子物质有很好的分离效果。缺点：由于凝胶层析是以物质分子量的不同作为分离依据的，分子量的差异仅表现在流速的差异上，所以分辨率不高，分离操作较慢。质谱法质谱法是利用电磁学的原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的方法。ZeU=mv22 e=1。6010-19 U：加速电压 m：离子的质量 Z：电荷数 v：离子被加速后的运动速度具有速度v的带电离子进入质谱仪的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终实现各种离子按m/z进行分离。优点：广谱性检测，几乎能测量所有物质的成份、结构；消耗样品少；灵敏度、分辨率、精确度都很高；方便串联其他仪器，形成组合，提高验证效率。缺点：经处理后，分子无生物活性；质谱仪器昂贵，维护极难。7、凝胶过滤和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法都是根据分子大小而对蛋白质进行分离的，并且都使用交联聚合物作为支持介质，为什么在前者是小分子比大分子更易留，而在后者则恰恰相反？答：凝胶层析与分子筛孔隙有关，其固定相是多孔凝胶，小分子会进入凝胶内孔隙，而大分子则在凝胶间隙中流动。小分子比大分子走过的路径长，所以小分子比大分子更易留在凝胶内。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质与阴离子表面活性剂结合，降低或者消除了蛋白质的表面电荷，使其带负电荷，同时，在水溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的结构，而分离胶中的孔径大小一致。大分子遇到的阻力比小分子大，所以大分子比小分子更易留在凝胶内。8、说明凝胶过滤层析的原理，它的用途有哪些，请列出3-5种？答：原理：凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，本身像个筛子”，不同类型凝胶的筛孔的大小不同。当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。用途：脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去。提纯：除去分子量差别较大的杂蛋白。分离不同分子量的蛋白质：若流速恒定的条件下，其保留时间也是一定的，所以凝胶过滤层析根据蛋白质不同的分子量可得到不同的保留体积，从而分离不同分子量的蛋白质。例如，分离同一蛋白的二聚体、三聚体、多聚体等形式。测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗脱后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。研究蛋白质配体有无相互作用：大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用。以凝胶为亲和层析的载体，对蛋白质-蛋白质复合物进行电泳，对比两种蛋白质单体的条带，可探知两种蛋白质是否有相互作用9、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(IEF)的原理。答：（蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子，蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点(pI)。）聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，其分辨率一般达到0.01个pH值，最高可达到0.001个pH值。它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点的位置。10、蛋白质翻译后加工与修饰有哪些形式、各有什么生物学意义？答：N-端fMet或Met的切除：蛋白质前体蛋白质在去掉N端一部分残基后变成有功能的蛋白质。二硫键的形成：两个半胱氨酸硫氢基可以氧化成二硫键，产生mRNA中没有相应密码子的胱氨酸。二硫键的正确形成对稳定蛋白质的天然构象具有重要的作用。剪切：在生物中有些蛋白要经过切除才能成为有活性的成熟蛋白。化学修饰1) 磷酸化磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将NTP(s)的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。可逆的磷酸化过程几乎涉及所有的生理及病理过程，如细胞信号转导肿瘤发生新陈代谢、神经活动肌肉收缩以及细胞的增殖发育和分化等。2) 糖基化糖基化修饰指在蛋白质肽链上加上短链的碳水化合物残基（寡糖或聚糖）的修饰。(O位糖基化、N位糖基化、C位甘露糖化、GPI (gly cophosphatidly inositol)锚定连接)(O位糖基化多发生在临近Pro的Ser或Thr残基上，糖基化位点处的蛋白多为构型。O位糖基化反应发生在细胞内两个部位，一是发生在高尔基体上，一是发生在细胞核或细胞质中。N位糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分泌蛋白和膜结合蛋白的Asn的氨基上结合寡糖的过程；C位甘露糖化是将一分子-mannopyranosyl残基通过C-C键连接到Ser吲哚环C-2上；GPI锚定连接指的是磷脂酰-纤维糖组在靠近蛋白C端部位结合，将蛋白连接到细胞膜上。)糖基化是真核细胞中特有的加工，这些蛋白质常和细胞信号的识别有关，如受体蛋白等。实际上几乎所有的分泌蛋白和膜蛋白都是被糖基化的蛋白。例如，对糖蛋白新生肽链的影响：参与新生肽链的折叠并维持蛋白质的正确的空间构象；影响亚基聚合；糖蛋白在细胞内的分拣和投送。对糖蛋白的生物活性的影响：保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期。参与分子识别的作用：控制蛋白质之间及其与配体之间的相互作用。概括来说，糖基化影响蛋白的功能，在许多生物过程中起着重要作用，如免疫保护、病毒的复制、细胞生长、细胞之间的黏附、炎症的产生等。糖基化异常经常导致疾病的发生，在帕金森病、风湿性关节炎和其它与自由基相关的疾病患者体内，检测到铁转移蛋白糖基化水平过高。铁转移蛋白是一种糖基化的金属转运血清蛋白，糖基化稳定了铁转移蛋白，间接地调节了铁离子的平衡。3) 泛素化标记旧的、被破坏的或者有缺陷的蛋白质，继而使其降解。泛素与蛋白的结合，蛋白酶将蛋白水解成小的肽段，整个水解过程需要能量参与。泛素化对于细胞分化、细胞器的生物合成、细胞凋亡、DNA修复、新蛋白生成、调控细胞增殖、蛋白质输运、免疫应答和应激反应等生理过程都起到很重要的作用。4) 乙酰化组蛋白乙酰化反应多发生在核心组蛋白N端碱性氨基酸集中区的特定Lys残基，由组蛋白乙酰转移酶催化将乙酰辅酶A的乙酰基转移到Lys的NH3+，中和掉一个正电荷。这样可减弱DNA与组蛋白的相互作用，使染色质构象松散，有利于转录调节因子的接近。乙酰化在生物体生长、发育、衰老的分子机理及其调节中具有重要意义。正常被抑制的区域高乙酰化或正常具有转录活性的区域去乙酰化，都可以导致各种紊乱，诱发与发育、增殖相关的疾病，如白血病、皮肤癌等。5) 甲基化蛋白质的甲基化修饰是在甲基转移酶催化下，在Lys或Arg侧链氨基上进行的甲基化。另外也有对Asp或Glu侧链羧基进行甲基化形成甲酯的形式。甲基化增加了立体阻力，并且取代了氨基的氢，影响了氢键的形成。因此，甲基化可以调控分子间和分子与目标蛋白的相互作用。11、什么是蛋白质磷酸化和糖基化？有哪些鉴定方法？答：磷酸化：磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将NTP(s)的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。糖基化：糖基化修饰指在蛋白质肽链上加上短链的碳水化合物残基（寡糖或聚糖）的修饰。鉴定方法：Edman降解法、质谱法、毛细管电泳、NMR、SDS-PAGE。12、细胞破碎的方法有哪些？答：机械：1) 研磨法：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中进行研磨或匀浆，可以加入少量石英砂提高研磨效果。此法较温和，适合实验室应用。2) 组织捣碎法：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎。在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性。物理：3) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15 到-20 ，然后放于室温(或40 )迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。4) 超声波处理法：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。为防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。5) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1.77108 Pa3.54108 Pa的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。6) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90 左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。化学、生物：7) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用8) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进细胞，引起细胞膜发生胀破，从而释放出细胞内含物。9) 酶解法：利用各种可以降解细胞壁的生物酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37 、pH8.0处理，可以专一性地将细胞壁分解，随之而来的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。10) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶(如蛋白酶和酯酶等)作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。但要注意某些有效成分可能会在自溶时分解。13、硫酸铵沉淀蛋白质的原理。答：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化层，降低其溶解度，使之在溶液中沉淀。利用不同浓度的盐溶液中蛋白质溶解度不同，可沉淀各种蛋白质。（蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的-COOH、-NH2和-OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1 nm100 nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。）14、His-Tag融合蛋白表达系统和GST融合蛋白表达系统分离纯化目的蛋白的原理是什么？各有何优劣。答：原理：His-Tag融合蛋白表达系统具有高亲和性的Ni-NTA树脂可以与含有6His标签的蛋白质或多肽特异性结合：NTA含有四配位鳌合基团，从而占据了Ni2+的6个球形配位键中的4个；His可以与固着在树脂上的Ni2+特异性地相互结合。优点1) 分子量小，一般不影响蛋白质的功能2) 能够稳定地与配体特异性结合，纯化简便3) 免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体4) 用于多种表达系统，纯化的条件温和5) 和其它的亲和标签一起构建双亲和标签缺点1)构建好His-Tag后，不挂柱。通常解释为Tag无游离性，被折叠到蛋白内部。解决办法：在蛋白N/C两端分别加上Tag，或者使用其他Tag，另外就是将蛋白变性后上柱。2) 对于一些容易被氧化的蛋白，特别是一些激酶，在加了His-Tag后，会在纯化过程中，显得很不安分，经常会形成沉淀，不容易被浓缩。GST融合蛋白表达系统：利用GST(glutathione-S-transferase)融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。该纯化柱中，凝胶手臂上通过硫键结合一个谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽(即GST-tag（26 KDa）)与谷胱甘肽巯基转移酶（即GST）之间，酶和底物的特异性作用力，使得带GST标签的融合蛋白能够与凝胶上的手臂谷胱甘肽结合，从而将带标签的蛋白与其他蛋白分离。优劣：优点：1) 增加外源蛋白的可溶性2) 可在不同的宿主中表达，适用范围广3) 可用不同的蛋白酶可以方便去除4) 高特异性，纯化方便且温和5) 提高外原蛋白的稳定性6) 很好保留了蛋白的抗原性和生物活性缺点：1) GST标签分子量较大，如处理不完全，可能会影响蛋白质功能和下游实验2) 若目的蛋白难溶，则很难用变性方法纯化蛋白15、离子交换层析的原理及应用，如层析介质的选择、蛋白质洗脱顺序等。答：原理：离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的。它在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。并且，它与溶液中的其它离子或离子化合物相互结合，本身的理化性质仍保持不变。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。假设以RA代表阳离子交换剂，它在溶液中解离出来的阳离子A+与溶液中的阳离子B+能发生可逆的交换反应：RAB+RB+A+在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子（离子在水溶液中发生水化作用形成的）的结合力是与离子的电荷量成正比，而与水合离子半径的平方成反比。所以，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力越大。对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于pI时，它们能被阳离子交换剂吸附；反之，pH高于pI时，它们能被阴离子交换剂吸附。若在相同的pH条件下，且pIpH时，pI越高，碱性越强就越容易被阳离子交换剂吸附。离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力，从而能够成功地把各种无机离子、有机离子或生命大分子物质分开。层析介质的选择在实际应用中，离子交换介质的基质、孔结构、配基密度（电荷密度或交换容量）、颗粒大小和分布都会影响介质的层析效果。亲水性基质往往比疏水性基质具有更好的生物相容性，更适用于蛋白质的分离纯化。目前常用的离子交换介质的基质大多是琼脂糖。介质的配基密度越大，越有利于提高介质的处理量和对蛋白质的吸附力，但由于蛋白质大分子与介质间的多位点结合，其构象可能发生变化，从而导致蛋白质的失活，同时这种多位点结合也可使大分子与介质间的结合过于牢固，难以洗脱，造成不可逆吸附。因此，合适的配基密度是实现大分子高效分离纯化的重要保障。介质颗粒越小，粒径分布越均匀，理论塔板数越高，分离效果越好。介质孔径越大，蛋白质分子越容易进入，介质的交换容量越高。蛋白质洗脱顺序由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。离子交换剂的选择任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品物质。因此，选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的重要环节。阴、阳离子交换剂的选择取决于被分离物质所带的电荷：如果被分离物质带正电荷，则选择阳离子交换剂；如果被分离物质带负电荷，则选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，则应根据其在稳定的pH范围内所带电荷来选择交换剂。强、弱离子交换剂的选择：一般地，强离子交换剂适用的pH范围很广，常用来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。常用弱离子交换剂适用的pH范围较窄，在中性溶液中交换容量也高，用它分离生命大分子物质时，其活性不易丧失。分离生物样品习惯采用弱离子交换剂。疏水性离子交换剂：基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂物质，常用的一类树脂是由苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物，并以共价键方式引入不同的电荷基团。如：MonoQ、MonoS亲水性离子交换剂：基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力大的物质。 常用的有纤维素、交联纤维素和交联琼脂糖等。离子交换柱的再生疏水性离子交换剂可以用24倍2 mol/L NaOH或2 mol/LHCl溶液处理；而亲水性离子交换剂则只能用0.5 mol/L NaOH 或0.5 mol/LNaCl 混合物或0.5 mol/L HCl处理(室温下处理0.5 h)。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。每次用酸(或碱)处理后，均应先用水洗涤至近中性，再用碱(或酸)处理。最后用水洗涤至中性，经缓冲液平衡后即可使用。16、已知某蛋白质由两条肽链组成。你是否能设计一个简便的实验，用来判断二条肽链之间是以共价键相连的，还是以非共价键相连的，并说明理由。答：对样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果电泳条带是2条，就说明两条肽链之间非共价键连接；如果电泳条带是1条，说明两条肽链是共价键连接。（原理：蛋白质变性剂可以破坏蛋白质之间的非共价键，却不会破坏共价键。）17、影响不连续电泳分辨率高的3个物理效应是什么？答：样品的浓缩效应待分离样品中的各组分在浓缩胶中会压缩成层，而使原来很稀的样品得以高度浓缩。1) 凝胶孔径的不连续性：浓缩胶为大孔胶；分离胶为小孔胶。在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。2) 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：在浓缩胶中，由于被分离物的pI介于前导离子和尾随离子的pK之间，共同向正极移动，并被浓缩成狭窄的条带。3) 电位梯度的不连续性：快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。凝胶的分子筛效应大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。一般电泳分离的电荷效应。各种带净电荷不同的蛋白质有不 同的迁移率。净电荷多，则迁移快；反之，则迁移慢。因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带。18、Southern blotting、Northern blotting、Western blotting答：Southern blottingSouthern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。方法：一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。Northern blottingNorthern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术。基本原理与相似方法：首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。Western blotting基本原理与方法：经过SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。19、为什么说蛋白质的一级结构决定其高级结构？有什么依据？答：蛋白质的一级结构是指蛋白质分子中由共价肽键相连的基本分子结构，若蛋白质分子中含有二硫键，一级结构也包括生成二硫键的半胱氨酸残基位置。不同的蛋白质，首先具有不同的一级结构，因此一级结构是区别不同蛋白质最基本、最重要的标志之一。例如，形成需要含羟基的丝氨酸、苏氨酸等且不能有脯氨酸的存在，也就是说连续的四个氨基酸1号和4号含羟基且其中无脯氨酸就可能形成-螺旋。20、简述蛋白质各级结构层次的含义及-螺旋结构、-折叠结构的特点。答：一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序（包括蛋白质分子中所有的二硫键的位置）。二级结构：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象 。三级结构：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，即肽链中所有原子在三维空间的排布位置四级结构：蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用。-螺旋：蛋白质多肽链呈右手螺旋状盘曲，每圈螺旋含3.6个氨基酸残基，每上升一圈沿螺旋轴方向上升0.54 nm（螺距），即每个氨基酸残基向上升高0.15nm，每个氨基酸残基绕螺旋轴旋转100 ；螺旋的直径约为0.5 nm；氨基酸残基的侧链伸向外侧；从N-末端出发，氢键是由每个肽键上的C=O氧与它前面第3个肽键上的N-H氢间形成的；链内氢键维持稳定性，相邻螺圈之间形成链内氢键，氢键的取向几乎与螺旋轴平行；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。-折叠：-折叠是由若干肽段或肽链排列起来所形成的扇面状片层构象。由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；主链骨架伸展呈锯齿状；涉及的肽段较短，一般为510个氨基酸残基；借相邻主链之间的氢键维系。氢键与肽链的长轴接近垂直；多肽主链呈锯齿状折叠构象；侧链R基交替分布在片层平面的两侧。21、蛋白质的空间结构与其生物功能有何关系？答：结构决定功能。蛋白质的功能是通过其空间构象的变化来实现的。例如：血红蛋白的变构现象血红蛋白是一个四聚体蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运输氧。研究发现，脱氧血红蛋白与氧的亲和力很低，不易与氧结合。一旦血红蛋白分子中的一个亚基与O2结合，就会引起该亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。22、解析蛋白质高级构象的技术方法有哪些？分别适用的对象是什么？各有何优缺点？答：X-射线晶体衍射、多维核磁共振波谱、电镜三维重构、中子衍射、紫外、红外、CD、拉曼、ESR、原子力显微镜X-射线晶体衍射适用对象：蛋白质晶体优点：x 射线衍射法的分辨率可达到原子的水平，使它可以测定亚基的空间结构、各亚基间的相对拓扑布局，还可清楚的描述配体存在与否对蛋白质的影响。缺点：NMR适用对象：蛋白质纯品优点：能对溶液中和非晶态的蛋白质进行测量。缺点：能够研究的分子量受到限制；灵敏度较低，需要较大样品量(若干mg)、较高溶解度(mmol/L)；长时间稳定性：数小时到数天；需要耗费较多的时间；实验和样品制备的费用都比较昂贵。CD适用对象：蛋白质纯品优点：它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏。缺点：圆二色谱测量仪器内部的光学原理繁复，维护较难。冷冻电镜适用对象：液体、半液体及对电子束敏感的样品优点：可对样品进行三维结构重构；可对生物大分子及其复合物或亚细胞结构进行测定；样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；无须制备晶体， 特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定；样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存； 结合新型的电子显微镜、制样机器人等设备和技术， 可以实现显微制样、数据收集、三维重构全过程的自动化或半自动化，为高通量、快速解析大分子及其复合物的三维结构打下基础。缺点：冷冻也可造成样品的人为损伤；断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。23、以血红蛋白为例说明蛋白质空间结构和功能的关系，并解释什么是协同效应和变构/别构效应。答：血红蛋白是一个四聚体蛋白质，具有氧合功能，可在血液中运输氧。研究发现，脱氧血红蛋白与氧的亲和力很低，不易与氧结合。一旦血红蛋白分子中的一个亚基与O2结合，就会引起该亚基构象发生改变，并引起其它三个亚基的构象相继发生变化，使它们易于和氧结合，说明变化后的构象最适合与氧结合。别构效应：由于小分子(O2)与大分子(Hb)亚基结合，导致蛋白质分子构象改变及功能变化的现象称为别构效应。小分子物质，称为别构效应剂。协同效应：一个亚基与其配体(O2)结合后，影响寡聚体中另一亚基与配体的结合能力的现象称为协同效应。起促进作用的，为正协同效应起抑制作用的，为负协同效应。蛋白质的空间结构决定了其生物学功能。血红蛋白能与氧结合，因为它以血红素为辅基，并且在血红素周围以疏水性氨基酸残基为主，形成空穴，为铁原子与氧结合创造了结构环境。血红蛋白是由四个亚基组成的寡聚蛋白，这样的空间结构决定了它的功能。血红蛋白的主要功用是在循环中转运氧。血红蛋白由4个亚基组成四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧，共结合4分子氧。血红蛋白也有可逆结合氧分子的能力，但血红蛋白各亚基与氧的结合存在着正协同效应。变构效应（allosteric effect）：当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高使血红蛋白的氧饱和曲线呈“S”形。这种由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象称为变构效应。引起变构效应的小分子称变构效应剂。变构效应在细胞蛋白与酶功能调节中有普遍意义。 协同效应(cooperativity)：一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应（positive cooperativity）；反之则为负协同效应（negative cooperativity）。当Hb中第一个亚基与O2结合后，引起其它盐键断裂促进第二、三、四亚基更易与O2结合，完成Hb的带O2过程，发生了亚基之间相互作用的正协同效应。带O2的Hb亚基结构松弛，呈松弛态(relaxed state，R态)。这时小分子(O2)与大分子(Hb)亚基结合，导致分子构象改变及生物功能变化的过程，发生了变构效应。血红蛋白特定空间构象及亚基间的正协同效应，则有利于Hb在氧分压高的肺部迅速充分的地与O2结合；而在氧分压低的组织发生相反过程，又迅速的最大限度的释出转运的O2，完成Hb的生理功能。24、结构基因组学的研究目的和研究内容。答：研究目的：利用结构基因组学所测定的未知蛋白质的结构。以快速、高通量（high throughput）的蛋白质结构测定