测定的指标和方法3-31.doc

1、总酚含量的测定（FoLin-CiocaLteu试剂刘老师买了，2-3天回来；到时候咱们用点就行了。自己配的话很麻烦）采用福林-酚法检测提取物的总酚含量 准确吸取0.2ml提取液于10ml试管中，加入1ml 1N的福林-酚试剂，摇匀，静置5min，加入4ml饱和的Na2CO3溶液，然后以双蒸水定容至10ml，在室温下避光放置2h，以空白为对照在760nm处测定其吸光值，重复测定3次。总酚含量分别表示为每克中草药粉末干重和提取物干重相当的没食子酸的量（mg）。没食子酸标准曲线的绘制：精密称取没食子酸标准品10.00mg，以双蒸水溶解并定容至100ml，摇匀，配成浓度为100mg/L的标准品溶液。精密吸取没食子酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml于10 ml试管中，分别加入1 ml1N的福林-酚试剂，摇匀，静置5min，加入4ml饱和的Na2CO3溶液，然后以双蒸水定容至10ml，在室温下避光放置2h，以空白为对照在760 nm处测定其吸光值。以没食子酸含量（mg）为横坐标，吸光值A760为纵坐标，进行线性回归得标准曲线方程Y=1.0477x+0.0438,R2=0.9964，FoLin-CiocaLteu试剂的配制（你们也再查查）：将100g钨酸钠(Na2WO4 2H2O), 25g钼酸钠( Na2MoO42H2O) ,700 mL蒸馏水，50 mL 85%磷酸及100 mL浓盐酸装入带回流装置的2000mL圆底烧瓶中，充分混合，文火缓慢回流10h,在加入150g硫酸锂(Li2SO4),50 mL蒸馏水及数滴液溴，然后将烧瓶内溶液开口煮15min，以驱除过量的溴，冷至室温后用容量瓶定容至1000mL，过滤。滤液呈微绿色。 吸取10 mL 1 moL/ mL的Na0H溶液，放入100 mL锥形瓶内，加入2滴酚酞指示剂，用上述滤液滴定。当溶液的颜色由绿经紫红到紫灰，到突然转变成墨绿色即为滴定终点。根据滴定所用的滤液量计算其酸度(相当于2 moL/ L HCL溶液)。将滤液稀释到H+浓度为1 moL/ L，此液即为FoLin酚试剂。将其置于棕色试剂瓶内，保存在冰箱中。用前稀释2倍。（1+1）福林-酚试剂配置方法：在2L的磨口回流装置内加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MO4.2H2O）25克，水700ml，35%磷酸50ml，浓盐酸100ml，文火回流10小时，然后加入硫酸锂50g，水50ml和溴水数滴，摇匀，去除冷凝器，继续煮沸15分钟，以去除多余多余的溴，溶液呈金黄色，冷却后，定容至1000ml，过滤后的滤液即福林-酚试剂（溶剂不应成绿色，否则重配），置于棕色瓶中保存采用 Folin-Ciocalteu 方法测定。以没食子酸为标样，在 765 nm 波长下测定吸光值，由吸光度对浓度进行回归，制作标准曲线，建立回归方程：Y=10.975x+0.0199，相关系数 r=0.9993。取提取液50微升放入试管中,接着加入1.0mLFolin一Cioealteu反应试剂 0.8 mL 7.5%的碳酸钠溶液,混合均匀在30度条件下放置60分钟反应在分光光度计上765mn测定OD值用没食子酸(Gallieacid)作标准曲线1.多酚类化台物及还原性物质(如抗坏血酸)等分子上有极易氧化的羟基,在碱性条件下能与FolinDenis试剂反应生成蓝紫色的化合物，可见光范围内有稳定的强烈吸收一定条件下遵从朗伯-比耳定律.Folin-Denis试剂,即磷钼钨酸试液,又名佛丹二氏 (Folin-Denis) 试剂:可取水约350ml，置于圆底烧瓶內，加钨酸鈉 50g，磷钼酸 12g 及磷酸 25ml，接以回流冷凝器，煮沸二小時，放冷，加水稀释至 500ml，混合均匀，制得，本品应置于密塞玻瓶中于冷暗处保存。2.Folin-Ciocalteu试剂:并用蒸馏水稀释成1:1;试剂A 1.56g 硫酸铜 100ml 试剂B 2,37g酒石酸钠 100ml 试剂C 2.0g NaOH+10g Na2CO3500ml 试剂D 100mlC+1mlA+1mlB 102ml (新鲜配制的碱性铜试剂)Folin-Ciocalteu试剂还原法测定总多酚,缺点是食物中其他还原性物质如抗坏血酸可能产生干扰.每次用前要新鲜配制2、黄酮含量测定（周2可以测，药品都有）见另外一个文件3、提取物总抗氧化活性评估采用铁还原/抗氧化能力（Ferric reducing/antioxidant power，FRAP）分析法。取适量上述样品提取液（必要时稀释），加入 1.8ml TPTZ 工作液（由 0.3moL/L 醋酸盐缓冲液 25 ml、10 mmoL/L TPTZ 溶液 2.5 ml、 20 mmol/L FeCl3溶液 2.5 ml 组成），混匀后 37 反应 10 min，593 nm 测定吸光度，以 1.0 mmol/L FeSO4 为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的 FeSO4的毫摩尔数表示试剂的配方：1）TPTZ 工作液现用现配：由25ml 300 mmol/L pH 3.6的醋酸盐缓冲液、2.5ml 10mmol/L TPTZ溶液、2.5ml 20mmol/L FeCl3溶液混合而成。A: 300 mmol/L醋酸盐缓冲液（PH3.5）取醋酸铵（分子量77）25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确调节PH值至3.5（电位滴定法），用水稀释至100（还是1000？你计算下）ml，即得。B: TPTZ是一种化合物1,3,5- tri(2-pyridyl)-2,4,6-triazine (C18H12N6, TPTZ)的缩写 2,4,6-三吡啶基三嗪（这个药品实验室估计没有，明天再找找，我买了，估计2-3天到）2）标准曲线的绘制：分别吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的FeSO4标准液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3ml标准系列，混匀，准确反应5min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零，绘制标准曲线。样品的抗氧化活性(FRAP值)以达到相同吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。3）样品的测定：量取0.1ml的样品溶液，加入3ml FRAP工作液，再加入0.3 ml待测样品，混匀，准确反应5 min，于593 nm处测定其吸光度，用超纯水调零。4、清除羟基自由基（OH）作用（周2可以测，药品都有）参照邻二氮菲-Fe2+氧化法稍加改进。 取0.75 mmol/L邻二氮菲溶液2 ml于试管中，依次加入 pH7.4 PBS 150 mmol/L 2 ml 充分混匀后，加 0.75 mmol/L 硫酸亚铁 2 ml，混匀，加 0.01的 H2O2 1ml，用蒸馏水定容至 10 ml (加蒸馏水3 ml)，混匀作损伤管，于 37下温育 60 min，于536nm 处测其吸光度，其值称 AP。未损伤管中不加 1ml H2O2，用 1ml 蒸馏水代替（其余的同AP），测得的吸光度称 AB。测定管待测液 0.5 ml （加蒸馏水2.5 ml）测得吸光度为 AS。OH 自由基清除率（）计算公式：pH7.4 PBS 150 mmol/L母液的配制： 0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水各种浓度PB(pH=7.4)的配制：先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可，如：0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.2M PB（PH=7.4） ：取 1000ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.15M PB（PH=7.4） ：取 750ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可。蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）：要液体培养后测菌的蛋白质含量Leaves: 0.2ml+1.8ml提取液+2ml考马斯亮蓝（100mg考马斯亮蓝溶于50 ml90%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，用蒸馏水定容到1L，过滤，贮藏与棕色瓶，常温可保存一个月）Roots: 0.2ml+0.8ml提取液+2ml考马斯亮蓝（100mg考马斯亮蓝溶于50 ml90%乙醇，加入100ml 85%的磷酸，用蒸馏水定容到1L，过滤，贮藏与棕色瓶，常温可保存一个月）2min后测定OD595标线用0.15mol Nacl配成2mg/ml 的牛血清蛋白原液，然后用缓冲液分别稀释至200ug/ml, 400ug/ml, 600ug/ml, 800ug/ml 和1000ug/ml 6个浓度，再加入考马斯亮蓝G-250染色液，于595nm测光密度FoLin-CiocaLteu试剂的配制：将100g钨酸钠(Na2WO4 2H2O), 25g钼酸钠( Na2MoO42H2O) ,700 mL蒸馏水，50 mL 85%磷酸及100 mL浓盐酸装入带回流装置的2000mL圆底烧瓶中，充分混合，文火缓慢回流10h,在加入150g硫酸锂(Li2SO4),50 mL蒸馏水及数滴液溴，然后将烧瓶内溶液开口煮15min，以驱除过