G418详细信息.doc

保存于运输说明： 2-8 详细信息： G418 sulfate (Geneticin) 现货供应说明：真核表达筛选用抗生素，可以用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株。筛选哺乳动物细胞，推荐起始筛选浓度为400微克/毫升；筛选植物细胞，推荐起始筛选浓度为10微克/毫升；筛选酵母，推荐起始浓度为500微克/毫升。根据起始浓度的效果可以再适当升高或降低G-418的使用浓度。 分子式：C20H 40N4O102H2SO4 分子量：692.71CAS：108321-42-2外观：白色粉末 特性：溶解性：可溶于水、甲醇、缓冲液和培养基。溶解后，0.22m过滤除菌，分成小包装，4可保存12个月，-20保存时间更长。最常用的储存液使用100mM HEPES(pH7.3)配制，浓度为50mg/ml。使用HEPES配制的好处是：加入储存液不会改变培养体系的pH值。 储存条件：2-8 Ordering InformationDescriptionQuantityPrice(RMB)Cat. no.产地G418 sulfate1g45011811-023Invitrogen5g200011811-023Invitrogen其他公司产品：产地货号规格促销价赠送Gibco11811-0231G450(元)单道计时器一个Gibco11811-0235G2000元送4G优盘一个AmrescoE5891G380元单道计时器一个AmrescoE5895G1250元送4G优盘一个Merck3458101G400元单道计时器一个Merck3458105G1610元送4G优盘一个PromegaV79831G420元单道计时器一个PromegaV79835G1700元送4G优盘一个G418溶液的配制配的时候就是用配好的HEPES溶G418，然后过滤，不用高压灭菌了，配好后分装，-20度保存，用的时候取一管放4度。100mM HEPES（pH7.3）缓冲液（500ml）ddH2O 490mlNacl 4gNa2HPO4-12H2O 0.1357gKcl 0.185gGlu 0.5gHEPES 2.5g用氢氧化钠调PH至7.3 ，定容至500mlG418贮存液（50mg/ml）的配制以下为细胞筛选的常用步骤：仅仅作为参考1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。3.制备筛选培养基：在100ug/ml1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。4.加G418筛选：吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。方法同4.6.确定最佳筛选浓度：在筛选1014天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug /ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml，这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。 通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50%70%汇合时；b 加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每35天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选1014天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1