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研究 苜蓿（紫花苜蓿）芽的乙酸乙酯萃取液抑制脂多糖在体内和体外诱导的炎症摘要本研究旨在探讨是否可以通过检查苜蓿芽乙酸乙酯提取物（ASEA）用于炎症性疾病发挥抗炎作用的主要成分。由此对患有急性炎症的BALB / c小鼠腹膜（IP）注射15毫克/公斤体重脂多糖（LPS）后的细胞因子的分布以及小鼠寿命进行了测定。 结果表明注射毒素在9小时之后LPS诱导的炎症小鼠寿命呈负的TNF-的血清水平，IL-6，和IL-1。同时相关数据表明，在后期阶段抑制这些细胞因子炎症对小鼠的生存是有益的。体外实验则表明ASEA显著减少的IL-6和IL-1的生产和有丝分裂原刺激的RAW264.7细胞的活性由NF-B的反式激活。为了进一步验证ASEA在体内的抗炎作用，以25毫克ASEA / kg体重/天在50l向日葵油管饲的BALB / c小鼠，对照以50微升葵花籽油/天PDTC（吡咯烷二硫代氨基甲酸，抗炎剂）组管饲的小鼠。管饲一周后，该PDTC组注射50毫克/公斤体重PDTC 1小时后，所有的小鼠注射15毫克/公斤体重的LPS。结果表明，ASEA和PDTC组在LPS攻击9小时后具有显著降低血清TNF-，IL-6，和IL-1水平的作用，与对照组相比具有显著的存活率。这项研究表明，ASEA具有抑制促炎性细胞因子的生产和缓解急性炎症的作用。背景越来越多的证据表明，全身性炎症是慢性疾病，如心血管疾病，癌症，和胰岛素抵抗的风险增加有关。该机理可能涉及巨噬细胞和T淋巴细胞活化，以及所释放的促炎细胞因子扩增炎症活性。炎症可以由促炎介体介导，包括肿瘤坏死因子（TNF）-，白细胞介素（IL）-1，IL-6，干扰素（IFN）-，IL-12，IL-18，一氧化氮，和介导细胞粘附分子。这些介质帮助先天免疫反应，但它们的过量会导致急性期内毒素血症发生，最终引起组织损伤，器官衰竭，休克，甚至死亡在这些介质中，促炎细胞因子如TNF-，IL-6和IL-1，它们也可以激活NF-B，同时通过NF-B的激活，从而放大该细胞因子级联反应扩大炎症状态。因为它们在炎症过程中起驱动作用，能有效地调节其异常的生产从而能够有利于减少炎症性疾病的发生。因此，除了消炎药外膳食成分的应用近期已成为一个关注焦点。而最近已经提出的饮食策略，则包括抗炎饮食对于慢性疾病与炎症相关的预防。苜蓿（紫花苜蓿）芽是经常食用的蔬菜沙拉。它的叶子或种子可作为营养的补充制成散装药草，胶囊剂和粉状片剂在保健食品商店出售。苜蓿芽，叶，和根的提取物已被证明在研究降低动物和人类胆固醇水平方面有帮助。此外，苜蓿芽或叶片在传统的药用使用中还包括治疗关节炎，肾脏疾病，以及疖子。然而，这些治疗仍然需要科学检查。我们以前的研究表明，苜蓿芽的乙酸乙酯萃取物可通过弱化细胞因子和炎症反应，改善狼疮小鼠的自身免疫倾向疾病。因此，本研究的目的是通过体内LPS诱导的炎症小鼠和苜蓿芽的乙酸乙酯萃取物在体外细胞培养的实验来探讨其抗炎作用。材料和方法试剂和材料试剂脂多糖（LPS，大肠杆菌血清型O55：B5），吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC）和刀豆球蛋白（续）A（Sigma化学公司;圣路易斯，MO，美国）均为分析纯，且溶于磷酸盐缓冲液盐水作为原液。新鲜的苜蓿（紫花苜蓿）芽（全球农庄有限公司;台北，台湾）冷冻干燥并且精细研磨成粉末。该粉末的近似组成为33.6的碳水化合物，49.6蛋白质，2.6脂肪，10.5的水，和3.7的灰分。苜蓿芽的粉末经乙酸乙酯萃取（EA1:40，w / v的，微克/毫升），并在室温下搅拌2天。所采样的溶剂溶液被收集并通过滤纸过滤（Whatman公司2号；Whatman公司纸业有限公司，梅德斯通）。上述苜蓿芽乙酸乙酯萃取液（ASEA）通过旋转式蒸发器除去溶剂，得到43.1毫克/克的收率并储存在-20。细胞培养实验将RAW264.7细胞（生物资源收集和研究中心;台湾新竹）培养在37下并保持湿润的且含有5二氧化碳，10牛胎儿血清（FBS），2mM谷氨酰胺，1非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的DMEM培养箱中。在这个实验中，RAW264.7细胞被接种在以2106个细胞/毫升为NF-B结合活性和mRNA的表达为细胞密度的6cm培养皿中，或以2104个细胞/200l/孔的细胞密度的96孔板中。在孵育前预先将细胞加入100纳克/ ml的LPS进行刺激，然后用各种浓度ASEA或PDTC（100M）处理1小时。根据以前的一份报告显示，PDTC的浓度被证明可以抑制RAW264.7细胞因子的产生。而ASEA可溶解在无水乙醇中对细胞进行治疗（最终乙醇浓度在介质0.1），对任一的RAW264.7细胞或原发性巨噬细胞都没有直接的毒性作用。 对于NF-B结合活性和细胞因子mRNA表达，分别经过24小时培养，将细胞裂解，以获得核提取物和总RNA。对于细胞因子的产生，需要经过48小时培养后收集细胞上清液用于细胞因子的测定，并在底部对细胞的生存能力进行了评估。原发性巨噬细胞培养基是将从BALB / c小鼠腹腔中分离渗出的细胞接种在细胞密度为2105个细胞/ 200微升/孔的96孔板上。经过3小时的孵育除去非贴壁细胞而粘附的细胞在使用各种浓度的ASEA（2，10，和50微克/毫升）之前1小时，先加入10微克/ 毫升的LPS进行刺激。经过48小时培养，收集细胞上清液测定细胞因子，进行所有的三个独立的体外细胞培养物实验。RNA分离，逆转录和实时PCR 该实验根据先前进行的研究，使用Trizol法从RAW264.7细胞（5106个细胞）中分离（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）出RNA，并使用4微克总RNA逆转录，10mM的dNTP（宝，滋贺县，日本），0.25微克寡聚dT（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州），5M-MLV反应缓冲液，和200单位M-MLV逆转录酶（Promega公司）最终的体积为15微升。将反应物在42下进行1小时，接着用5分钟，从90缓慢冷却至4下并保持10分钟。产物进行实时PCR时使用特定基因和SYBR Green PCR主混合物（Bio-Rad实验室公司，赫拉克勒斯，CA，USA）的引物组。用于小鼠IL-6的引物组是5-ACAGAAGGAGTGGCTAAGGAC-3和5-GCTTAGGCATAACGCACTAGG-3。用作内部对照引物组的是5-CTATTGGCAACGAGCGGTTCC-3与5-GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3的肌动蛋白和5-TGTGTCCGTCGTGGATCTGAC-3与5-GATGCCTGCTTCACCACCTTC-3的GAPDH。结果由一个Ct值比较确定，并用iCycler iQ的实时PCR检测系统进行分析（Bio-Rad公司实验室）。对照的Ct值被用作参考，所有的PCR反应均重复运行。NF-kB依赖的报告基因分析使用报告基因质粒、3-Btk的萤光素酶、上游胸苷激酶（TK）启动子的B结合位点上含有的三个副本和pRL载体上荧光素酶报告基因（M.博士Kashiwada，美国国立卫生研究院，日本）对NF-B结合位点中的转录激活进行测定。简言之，就是将RAW264.7细胞接种在以1105个细胞/ 毫升/孔的24孔板中，对贴壁细胞培养18小时，然后在100l无血清培养基的OPTI-MEM上（Gibco BRL公司，马里兰州盖瑟斯堡，美国）使用转染的0.2微克3倍-Btk的萤光素酶和0.1微克的pRL-TK萤光素酶（2：1）使每孔含1微升脂质体2000（Invitrogen公司）。5小时后，将培养基更换为含有100毫微克/毫升的LPS和1000单位/ 毫升，存在或不存在不同浓度ASEA的IFN-（Sigma公司）的无血清OPTI-MEM。经过8小时的温育，去除上清液并对荧光素酶的报告基因进行分析。根据制造商的说明使用发光测定发光微板计数仪（Wallac维克多-2-珀金埃尔默，诺瓦克，MT，美国）对荧光素酶进行测定。荧光素酶活性（表示为任意光单位），可以通过对样品中的蛋白质浓度，用转染效率标准化或者半乳糖苷酶的活性进行纠正。实验重复三次，并显示出相同的倾向。检测NF-B的DNA结合活性用市售的试剂盒（Active Motif公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国）对LPS刺激的RAW264.7细胞进行核蛋白质提取并对DNA结合活性NF-B测定。首先用PBS/磷酸酶抑制剂缓冲液将细胞洗涤两次，收集细胞沉淀物细胞重新悬浮在低渗缓冲液冰面上。然后用Nonidet P-40.通过30秒离心使核以14000g下沉淀。轻轻摇晃颤抖的平台，使含有细胞核的沉淀重新在提取缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）中悬浮。在14000g下离心10分钟，收集含核蛋白上清液。核裂解物的蛋白质浓度用二辛可宁酸测定法测定（Pierce化学公司，Rockford，IL，美国）。根据制造商的说明（活性基序），首先使用NF-kB p65的TRANSAM法对核蛋白质提取物NF-kB的p65亚基蛋白中的DNA结合活性进行检测。简言之，在室温下振摇100转，同时用指定的核蛋白质提取物（2.5微克/样品）将包含所述NF-B共有序列的寡核苷酸固定在96孔平板上，培养1小时。然后将板洗涤并孵育抗p65蛋白1小时，再经过广泛的洗涤后，该平板接着孵育过氧化物酶缀合的第二抗体1小时。上述过氧化物酶活性用ELISA读数器（EL311，生物-TEK公司威努斯基，VT，美国）测定可视为四甲基联苯胺反应和450nm处的吸光度。动物实验和LPS-急性攻击炎 国立台湾大学（台北，台湾）医学院的动物中心将明暗周期稳定在12小时，并装在不锈钢玻璃水瓶笼子内喂养含AIN-76饮食的5到6周龄雌性BALB / c小鼠保持在232温度的空调房间里。在10周龄时，根据国家研究院动物护理和处理符合实验动物的护理和使用卫生指南，对小鼠开始实验性治疗或饮食的补充。 将15毫克/千克体重（BW）的LPS注射到30只10周龄的BALB / c小鼠腹膜内（IP）获得在急性炎症期间的血清细胞因子分布。血清是通过3-4只小鼠在每个时间点0，1.5，2，4，6，9，12和24小时，LPS不重复攻击后，而从同一小鼠眼眶出血获得的。为了探讨血清促炎性细胞因子水平与寿命之间的相关性， 对66 只10周龄BALB / c小鼠注射15毫克/公斤体重LPS进行刺激，分别在2小时和9小时后收集小鼠的血清，并记录这些小鼠的寿命。ASEA补充之前LPS诱导的急性炎症40只10周龄大的BALB / c小鼠被随机分成三组：对照组（n= 15只）和PDTC（n=9只，作为阳性对照）组均以50微升的向日葵油（SO）/天管饲，而ASEA组（n=16只）则在50微升的SO/天，以25毫克/千克体重ASEA管饲。根据先前的报告，在初级腹腔巨噬细胞中ASEA这种口服剂的有效剂量为（50微克/毫升）。而PDTC这个阳性对照组中的少量小鼠在我们的实验室不同的实验中已经被反复表现出相似的结果。另外分别管饲的小鼠要么用SO要么用ASEA，每天同时都要喂养含AIN-76的食物和水。一周后，所有小鼠的腹腔注射15毫克/公斤体重的LPS以诱导急性炎症。据报道，在LPS刺激前1小时，首先给PDTC组的小鼠腹腔注射具有抗炎作用的PDTC 50毫克/ 千克体重，然后分别收集用LPS刺激细胞因子2小时和9小时后的血清并进行分析，最后随机记录下寿命较长且继续喂食AIN-76的小鼠。产生细胞因子的试验用商业ELISA试剂盒测定，在细胞上清液和小鼠血清中生产的细胞因子TNF-，IL-6和IL-1。简言之，就是将抗IL-6（BD Pharmingen公司，圣地亚哥，CA，美国），TNF-或IL-1（R和D，明尼阿波利斯，MN，USA）的抗体涂敷到96孔板上。温育后，将板中的孔先用封闭溶液（PBS缓冲液含1牛血清白蛋白，Sigma制）洗涤，然后用经过稀释的上清液或血清中的溶液再次洗涤。在洗涤孔中加入生物素结合的抗IL-6，TNF-或IL-1的抗体2小时，然后将孔洗涤和辣根过氧化物酶偶联的链霉（Pierce化学公司）加入30分钟，洗涤，及温育以ABTS（2，20连氮基 - 双（3- ethylbenzthazoline-6-磺酸），Sigma公司）或TMB （四甲基联苯胺;临床科学产品，曼斯菲尔德，MA，USA）。最后用ELISA读数器（EL311，生物-TEK公司制） 对吸光度在405nm或620nm处测定，该数据是根据细胞因子的标准曲线来计算。统计分析 数据表示为平均值SD或平均值SEM。相比于对照组的显著差异可使用小鼠t检验的SAS软件来分析方案（SAS/STAT8.0; SAS研究所，凯里，北卡罗来纳州，美国）。血清促炎细胞因子水平和存活之间的关系是由SAS程序的简单相关性进行分析的。比较两者之间不同的生存曲线是由COX的比例风险回归测试（;Stata公司，学院站，德克萨斯州，美国STATA6.0版）进行分析统计。AP值小于0.05被认为是显著统计学。结果LPS攻击释放的促炎性细胞因子的小鼠血清 受LPS攻击在BALB / c小鼠，1.5小时血清TNF-水平最高达到（6.860.25纳克/毫升），然后超过12小时迅速下降到基础水平（0.160.05纳克/毫升）（图1A）。在4小时，血清I