人类染色体的制备.ppt

人类染色体的制备 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 目的和要求 了解人类外周血淋巴细胞的培养方法 掌握染色体标本的制备方法 材料 培养人的外周血淋巴细胞 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 实验原理 在健康成年人外周血中 含有红细胞 白细胞和淋巴细胞 红细胞没有细胞核 无法得到染色体 只能通过淋巴细胞得到染色体 在通常情况下 它们都处在间期的G1期或G0期 一般情况下不进行分裂 但在体外适宜培养条件下 它们经有丝分裂原如植物血凝素 PHA 的作用可转化成为淋巴母细胞 而重新进行有丝分裂活动 因此 当该类细胞在人体外经PHA刺激短期培养后 经秋水仙素处理使正在分裂的细胞停止在中期 再经低渗和固定等处理 即可得到较多可供分析的中期染色体标本 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 试剂 植物血凝素 PHA 刺激外周血淋巴细胞从G0期返回正常细胞周期 秋水仙素 colchicine 作用 阻止微管组装 中期染色体无法排列赤道板 抑制姐妹染色体的分离 将细胞停留在中期 目的 获得大量的中期细胞 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 其他试剂 低渗液 0 075mol L氯化钾 能使细胞膨胀 便于染色体分散而易于观察和计数固定液 甲醇与冰醋酸按3 1配制 稳定染色体的形态结构 清除染色体外层物质对染色体在玻片上展开的影响 通过更换固定液2 3次 清除红细胞的碎片 使标本片的背景更为清晰 现用现配 Giemsa染液 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 实验步骤 1 人类外周血淋巴细胞的培养提取血液在含PHA 血清的培养基中培养72小时 大多数细胞进入第二细胞周期 实验前4小时加入秋水仙素 实验时 多数细胞停留在中期 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 2 染色体标本制备1 摇匀培养物 吸取培养物于离心管中 2 2000r m离心6min 注意配平 吸弃上清液 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 3 低渗 加入预温37 的6mlKCl 0 075M 吹打混匀沉淀 37 水浴15min 以达到红细胞破裂 淋巴细胞膨胀和染色体分散的目的 4 预固定 加入新配置固定液 甲醇 冰醋酸 3 1配制 1ml 混匀 2000r m离心6min 吸弃上清 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 5 固定 加入6ml固定液 混匀 室温放置10min 6 2000r m6min 吸弃上清液 7 再固定 重复5 6步一次 8 加入0 5ml固定液 非常小心混匀沉淀 制成细胞悬液 9 将混合液从30cm左右高度滴2 3滴于冰湿的载玻片上 空气凉干 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 3 染色滴加数滴Giemsa 染色3 5min 自来水冲洗 空气凉干 人类外周血淋巴细胞染色体标本制备 1 摇匀培养物 吸取培养物于离心管中 2 2000r m离心6min 倒去上清液 3 低渗 加入预温37 的6mlKCl 0 075M 吹打混匀沉淀 37 水浴15min 4 预固定 加入新配置固定液1ml 混匀 2000r m离心6min 倒去上清 5 固定 加入6ml固定液 混匀 室温放置10min 6 2000r m6min 倒去上清液 7 再固定 重复5 6步一次 8 加入0 5ml固定液 非常小心混匀沉淀 制成细胞悬液 9 将混合液从